欒海燕，李廣文，李　卉，王　軍，辛　越，楊朝艷，田　青，何　偉，齊志遠(yuǎn)，曹思樟，呂波濤，裴永泉，梁　政，程碩

?

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、純化與鑒定

欒海燕，李廣文，李卉，王軍，辛越，楊朝艷，田青，何偉，齊志遠(yuǎn)，曹思樟，呂波濤，裴永泉，梁政，程碩

[摘要]目的探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）體外培養(yǎng)、純化及鑒定的方法。方法對(duì)1 w齡SD大鼠脫頸處死后，剝離大鼠兩側(cè)后肢股骨和脛骨提取BMSCs，采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)、純化BMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，繪制生長(zhǎng)曲線，并通過成骨、成脂誘導(dǎo)、克隆形成率等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)法體外分離、純化、培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs生長(zhǎng)迅速、生長(zhǎng)曲線較好，經(jīng)過成骨、成脂、克隆形成率等方法鑒定證實(shí)其為SD大鼠BMSCs。結(jié)論全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法是分離、純化與培養(yǎng)BMSCs的一種有效方法，能較快獲得增殖能力較強(qiáng)的原代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；原代培養(yǎng)；純化；大鼠

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s，BMSCs）是骨髓內(nèi)存在的一類非造血干細(xì)胞，也稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（marrow stroma1 stem ce11s，MSCs）。其來(lái)源于中胚層間充質(zhì)，在體內(nèi)外具有支持和調(diào)控成骨的作用，并且在體內(nèi)可分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能，能夠向成骨系細(xì)胞、成纖維系細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分化，因此也是多能或全能干細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中獲取符合要求的BMSCs就必須將其在體外進(jìn)行分離、純化、鑒定和增殖，以獲取足量符合要求的BMSCs。本研究采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)獲取SD大鼠BMSCs，并對(duì)其進(jìn)行多向分化和增殖潛能的鑒定，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要材料和設(shè)備1 w齡SD大鼠[第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SCXK（軍）2013-009]，體重為50～80 g；酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）；α-MEM培養(yǎng)基（Hyc1one，美國(guó)）；胎牛血清（SC浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；青霉素/鏈霉素（Sigma，美國(guó)）；L-谷氨酰胺；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、L-抗壞血酸（Vc）、地塞米松（Dex）、β-甘油磷酸鈉（β-GP）、胰島素、二甲基亞砜（DMSO）、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O、CCK8試劑（Sigma，美國(guó)）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國(guó)）；HERACELL細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，德國(guó)）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（CK40-F200，O1ymPas，日本）；體視顯微鏡（SZX-9，O1ymPas，日本）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)將1 w齡健康SD大鼠脫頸處死后，75%酒精浸泡消毒3 min，在超凈工作臺(tái)無(wú)菌環(huán)境下使用原代器械盒冰上剝離出股骨和脛骨，放置于預(yù)冷的PBS溶液培養(yǎng)皿中，而后剪去股骨和脛骨兩端，用1 m1注射器吸取10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓3次，至骨髓腔變白，收集所有沖洗培養(yǎng)液于10 m1離心管中。將收集好的離心管4℃1000 r/min離心5 min，去掉上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。放置在37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)，3 d后對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行半換液，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況；5 d后全換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7～10 d左右，細(xì)胞呈較為均勻的成纖維細(xì)胞樣，緊貼培養(yǎng)瓶壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿90%左右，僅有部分雜細(xì)胞，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)當(dāng)看到細(xì)胞呈較為均勻的成纖維細(xì)胞樣，緊貼培養(yǎng)瓶壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿90%左右時(shí)方可以進(jìn)行傳代，一般按照1∶2或1∶3進(jìn)行傳代。具體方法是：倒掉廢液，用5～10 m1 PBS液漂洗1～3次，倒置顯微鏡下觀察死細(xì)胞或衰老細(xì)胞是否洗凈；而后加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶2～3 m1，置37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行消化；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，細(xì)胞凸起縮為圓形時(shí)，加入等量的10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液終止消化，并使用滴管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底壁細(xì)胞，注思不要產(chǎn)生氣泡影響細(xì)胞活性。收集培養(yǎng)液于10 m1離心管中，4℃1000 r/min離心5 min，去掉上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，等量接種于2～3個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定取第2～5代BMSCs，按上節(jié)方法進(jìn)行消化、離心、重懸細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度到5×103個(gè)/m1，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按200 μ1/孔細(xì)胞懸液接種至96孔板，分為12組，每組8孔，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)。以后每日取1組（8孔），吸除廢液，加入100 μ1培養(yǎng)液及10 μ1 CCK8溶液孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。另取96孔板，從原培養(yǎng)板添加CCK8孔中吸取100 μ1溶液至新96孔板中，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)得OD值，計(jì)算每組均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用GraPhPad Prism 5軟件繪制以天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞均值數(shù)為縱坐標(biāo)的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4細(xì)胞鑒定

1.2.4.1克隆形成取第3代BMSCs并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以×103個(gè)/100 mm培養(yǎng)皿接種細(xì)胞，加入10%胎牛血清的培養(yǎng)液至8 m1，于37℃、5%CO2孵箱箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。第14 d后，PBS清洗，2.5%戊二醛固定15 min，之后加入8 m1 0.1%甲苯胺藍(lán)染色15 min，PBS漂洗2次，置于體式顯微鏡下對(duì)細(xì)胞克隆形成情況進(jìn)行計(jì)數(shù)（＞50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)記作1個(gè)克?。?，并計(jì)算克隆形成率（克隆形成率＝細(xì)胞克隆數(shù)÷接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)×100%）。以上計(jì)數(shù)重復(fù)3次。

1.2.4.2成脂誘導(dǎo)分化將第3代BMSCs以5× 105個(gè)/孔接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、融合＞90%時(shí)，加入脂誘導(dǎo)液（5%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，100 nM地塞米松，0.5 mM IBMX，50 mM吲哚美辛，0.01 mg/m1胰島素，50 μg/m1的抗壞血酸）誘導(dǎo)2 w，每4 d換液1次。2 w后倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況，PBS清洗3次，5 min/次，2.5%戊二醛固定15 min，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4.3成骨誘導(dǎo)分化將第3代BMSCs以5× 105個(gè)/孔接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、融合＞90%時(shí)，加入骨誘導(dǎo)液（5%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，10 mM β-甘油磷酸鈉，50 μg/m1抗壞血酸，100 nM地塞米松）培養(yǎng)，每4 d換液1次。一部分細(xì)胞成骨誘導(dǎo)1 w后，采用堿性磷酸酶試劑盒染色，倒置顯微鏡下觀察ALP的形成；其余細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)至4 w，茜素紅染色漂洗后，倒置顯微鏡下觀察礦化情況并拍照。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)初接種的BMSCs一般懸浮于培養(yǎng)液中，2 h后逐漸貼壁生長(zhǎng)，1 d時(shí)細(xì)胞較圓，密集分布（圖1A）；37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)3 d后，首次半換液，可見部分細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，部分雜細(xì)胞仍呈類圓形（圖1B）；培養(yǎng)5 d全換液后，BMSCs開始集落，多數(shù)呈成纖維細(xì)胞樣，仍有少量雜細(xì)胞（圖1C）；培養(yǎng)10 d后，雜細(xì)胞基本消失，細(xì)胞呈較為均勻的成纖維細(xì)胞樣，緊貼培養(yǎng)瓶壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿90%左右，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖1D）。繼續(xù)傳代得到第2、3代細(xì)胞，純化的細(xì)胞呈現(xiàn)均一的成纖維細(xì)胞樣，旋渦狀或輻射狀整齊有序排列，即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖2所示，生長(zhǎng)曲線呈“S”形，前1～2 d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，處于生長(zhǎng)潛伏期；自第3 d起，細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，并在第7 d達(dá)到增殖平臺(tái)期，細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)趨于平緩。

圖2　第3代BMSCs的生長(zhǎng)曲線

2.3細(xì)胞鑒定BMSCs低密度接種，37℃、5% CO2培養(yǎng)14 d，可見集落樣生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆團(tuán)塊（圖3A），克隆形成率為（22.5±2.9）%。使用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成脂分化2 w后，油紅O染色，可見細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間分布著紅色脂滴（圖3B）。使用成骨誘導(dǎo)液成骨誘導(dǎo)1 w后，可見細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色結(jié)晶（圖3C）；使用成骨誘導(dǎo)液成骨誘導(dǎo)4 w后，經(jīng)茜素紅染色后，可見形成不規(guī)則的紅色礦化結(jié)節(jié)（圖3D）。

3　討論

BMSCs屬于多能或全能基質(zhì)干細(xì)胞，具有分化為多種細(xì)胞的潛能，如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，在形態(tài)上其與成纖維細(xì)胞相似。目前常用體外分離純化培養(yǎng)大鼠BMSCs的方法主要包括全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀法、特制培養(yǎng)板篩選法和免疫磁珠法等[1]。從綜合各個(gè)方面考慮，全骨髓貼壁培養(yǎng)法較為常用、且操作相對(duì)簡(jiǎn)易。

全骨髓貼壁法即取自動(dòng)物股骨和脛骨的全骨髓加入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，接種3 d后半換液。也有研究表明延長(zhǎng)首次換液時(shí)間有利于細(xì)胞的貼壁和增殖，因?yàn)椴毁N壁細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能對(duì)于干細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，首次換液時(shí)間最長(zhǎng)可在7～10 d進(jìn)行[2]。首次換液后，每2 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%即可首次傳代。本實(shí)驗(yàn)采取貼壁離心法，操作簡(jiǎn)易，需要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備較少，BMSCs制備純度也較高。

CCK8是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的常用方法，具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[3]。通過CCK8檢測(cè)SD大鼠BMSCs的生長(zhǎng)曲線，表明分離純化培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有一定的增殖能力和自我更新能力[4]。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線看，全骨髓貼壁法培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs增殖迅速、生長(zhǎng)曲線良好，證明獲得的SD大鼠BMSCs具有很好的增殖能力，活性很強(qiáng)。

圖1　SD大鼠BMSCs不同培養(yǎng)時(shí)間生長(zhǎng)情況A：培養(yǎng)1d；B：培養(yǎng)3d；C：5d；D：10d

圖3　BMSCs的克隆形成及體外多向分化潛能鑒定

克隆形成鑒定是BMSCs研究中的常用方法，主要原理是將細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液，然后接種培養(yǎng)基，根據(jù)集落形成數(shù)量和大小來(lái)判斷細(xì)胞增殖能力和群體依賴能力[1，6-7]。同時(shí)，多向分化潛能也是BMSCs的重要特征。本實(shí)驗(yàn)通過體外成脂、成骨誘導(dǎo)對(duì)SD大鼠BMSCs多向分化潛能進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)后，成骨早期指標(biāo)之一的堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，證明分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs開始向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化；而成骨誘導(dǎo)4 w后經(jīng)過茜素紅礦化染色發(fā)現(xiàn)，鈣化結(jié)節(jié)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，出現(xiàn)了典型的成骨細(xì)胞特性，表明SD大鼠BMSCs具有成骨分化潛能。在成脂誘導(dǎo)2 w后，細(xì)胞胞漿及細(xì)胞間發(fā)現(xiàn)脂滴，油紅O染色出現(xiàn)明顯紅色脂滴，證實(shí)分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs開始向成脂細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分離、純化培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs是符合實(shí)驗(yàn)要求的具有自我更新和增殖能力，以及多向分化潛能的干細(xì)胞，可為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et a1. Mu1ti1ineage Potentia1 of adu1t human mesenchyma1 stem ce11s [J]. Science，1999，284:143-147.

[2]Jaiswa1 N，Haynesworth SE，CaP1an AI，et a1. Osteogenic differentiation of Purified，cu1ture-exPanded human mesenchyma1 stem ce11s in Vitro[J]. J Ce11 Biochem，1997，64:295-312.

[3]熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性之測(cè)試條件比較[J].激光生物學(xué)報(bào)，2007，10:559-562.

[4]Bag1ioni S，Cantini G，Po1i G，et a1. Functiona1 differences in Viscera1 and subcutaneous fat Pads originate from differences in the adiPose stem ce11[J]. PLoS One，2012，7:e36569.

[5]Fukumoto T，SPer1ing JW，Sanya1 A，et a1. Combined effects of insu1in-1ike growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on Periostea1 mesenchyma1 ce11s during chondrogenesis in Vitro [J]. Osteoarthr Carti1，2003，11:55-64.

[6]Gimb1e J，Gui1ak F. AdiPose-deriVed adu1t stem ce11s: iso1ation，characterization，and differentiation Potentia1 [J]. CytotheraPy，2003，5:362-369.

[7]Jankowski RJ，Deasy BM，Huard J. Musc1e-deriVed stem ce11s[J]. Gene Ther，2002，9:642-647.

Cu1tiVation，dePuration and identification of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s

Luan Haiyan1，Li Guangwen2，3，Li Hui4，Wang Jun6，Xin Yue2，Yang Chaoyan5，Tian Qing3，He Wei3，Qi Zhiyuan6，Cao Sizhang3，Lü Botao6，Pei Yongquan7，Liang Zheng6，Cheng Shuo6

1. B1ood Center of Yantai City，Yantai，Shandong，264000，China；2. State Key Laboratory of Mi1itary Stomato1ogy，Co11ege of Stomato1ogy，the Fourth Mi1itary Medica1 UniVersity，Xi'an，Shaanxi，710032，China；3. Unit 96617 of PLA，Luzhou，Sichuan，646000，China；4. DePartment of EPidemio1ogy and Hea1th Statistics，West China Schoo1 of Pub1ic Hea1th，Sichuan UniVersity，Chengdu，Sichuan，610041，China；5. DePartment of Pediatrics，PeoP1e's HosPita1 of Luzhou City，Luzhou，Sichuan，646000，China；6. HosPita1 537 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China；7. Unit 96411 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China

[Abstract]ObjectiVe To exP1ore the cu1tiVation，dePuration，and identification methods of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s（BMSCs）in Vitro. Methods Necks of one-week-o1d SD rats were taken off for death，their hind 1imb femurs and tibias on both sides were striPPed in order to abstract BMSCs. Who1e bone marrow adherent method was used to seParate，cu1ture，and Purify BMSCs. Ce11 morPho1ogic changes were obserVed，and the growth curVe was drawn. The identification was carried out by the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency. Resu1ts SD rats' BMSCs grew raPid1y，and the growth curVe was good. Through the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency，those ce11s were identified as SD rats BMSCs. Conc1usion Who1e bone marrow adherent method is an effectiVe way to seParate，Purify，and cu1ture the BMSCs，which can raPid1y obtained the Primary ce11s with better Pro1iferatiVe caPacity for exPeriment and research use.

[Key words]bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11；Primary cu1ture；Purification；rat

收稿日期：（2015-08-12）

通訊作者：李廣文，電話：029-84776159；E-mai1: fes1gw_4138@ 163.com

基金項(xiàng)目：軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（2014KB11）

文章編號(hào)1004-0188（2016）02-0117-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2016.02.001

中圖分類號(hào)R 329.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

作者單位：264000山東煙臺(tái)，煙臺(tái)市中心血站（欒海燕）；軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（李廣文，辛越）；解放軍96617部隊(duì)（李廣文，田青，何偉，曹思樟）；四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系（李卉）；瀘州市人民醫(yī)院兒科（楊朝艷）；解放軍537醫(yī)院（王軍，齊志遠(yuǎn)，呂波濤，梁政，程碩）；解放軍96411部隊(duì)（裴永泉）