曾玉曉，徐玲瓏，吳迪炯，葉寶東，高雁婷，劉文賓，周郁鴻

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院血液科， 杭州 310006)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：207- 212

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是免疫介導(dǎo)的血小板過(guò)度破壞、巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常，血小板生成相對(duì)不足的自身免疫性疾病。ITP的治療，目前主要從激素、丙種球蛋白沖擊、切脾、化療等方面著手，取得了一定療效。對(duì)于難治性血小板減少癥患者，抗CD20單克隆抗體(美羅華)已成為重要的選擇手段之一，但其存在著價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)期療效尚有無(wú)法確定的不足。目前，已有采用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)治療ITP[1]的個(gè)案報(bào)道，但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究仍相對(duì)缺乏。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)來(lái)源豐富，增殖分化能力強(qiáng)[2- 3]。因此，本實(shí)驗(yàn)探索hUC-MSCs對(duì)難治性免疫性血小板減少癥(refractory immune thrombocytopenia，rITP)患者外周血B細(xì)胞分化及分泌功能的影響。

資料與方法

病例來(lái)源

病例資料為2012年6月至2013年10月本院rITP患者26例，男性10例，女性16例，中位年齡44(12～68)歲。健康供者6例，男性4例，女性2例，中位年齡28(21～40)歲。

rITP患者納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)脾切除后無(wú)效或復(fù)發(fā)者或依賴激素者；(2)仍需治療以降低出血的危險(xiǎn)；(3)除外其他引起血小板減少癥的原因，確診ITP。

hUC-MSCs的提取[4]及純度鑒定

人臍帶由浙江省杭州市第一人民醫(yī)院提供，通過(guò)了浙江省中醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理批準(zhǔn)。將無(wú)菌臍帶用含有青鏈霉素雙抗的PBS清洗；剝離華通氏膠，將華通氏膠剪碎至約2 mm×2 mm×2 mm大??；用0.2%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化4～5 h；消化物用50目、200目濾網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾液用PBS稀釋，分別以2 000 r/min×15 min、1 500 r/min×15 min、800 r/min×5 min離心，棄上清液；計(jì)數(shù)，細(xì)胞以7.5×105個(gè)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，48 h后首次換液，細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)胰酶消化，以0.5×105/L傳代培養(yǎng)。取第三代的hUC-MSCs，用CD44、CD31標(biāo)記hUC-MSCs用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。

健康供者及rITP患者外周血B細(xì)胞的分離及共培養(yǎng)體系的建立

用人外周血淋巴細(xì)胞分離液以密度梯度離心法分離出rITP患者及健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為7.5×107/L，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19標(biāo)記的細(xì)胞。胰酶消化融合度90%的hUC-MSCs細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105個(gè)接種于培養(yǎng)皿，貼壁3 h后，分別以hUC-MSCs∶單個(gè)核細(xì)胞0.5∶10、1∶10、2∶10、4∶10、8∶10建立共培養(yǎng)體系。

美洲商陸刺激B細(xì)胞分化及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)抗體IgM、IgG分泌量

將濃度分別為30、10、1 mg/L的美洲商陸(Pokeweed，PWM)加入健康供者外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞中培養(yǎng)2、4、7 d，按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的吸光度值(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算兩種抗體的濃度。外周血單個(gè)核細(xì)胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d，收集上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的OD值，計(jì)算兩種抗體的濃度。

EnVision免疫組化法測(cè)B細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白-1的表達(dá)

外周血單個(gè)核細(xì)胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d，CD138標(biāo)記細(xì)胞。EnVision二步法免疫組化，檢測(cè)B細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1(B lymphocyte-induced maturation protein1，Blimp- 1)被抑制程度。陽(yáng)性率(positive rate, PR)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(陰性細(xì)胞數(shù)+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))×100%。

計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[5- 6]：(1)陽(yáng)性強(qiáng)度的判斷：按著色細(xì)胞染色強(qiáng)弱判斷，細(xì)胞染色呈陰性為(-)；染色弱，陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色為(+)；染色中等，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色為(++)；染色強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色為(+++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)分別用0、1、2和3分表示。(2) 陽(yáng)性率的判斷：沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)為(-)，陽(yáng)性率小于25%的計(jì)為(+)，陽(yáng)性率介于26%～50%之間的計(jì)為(++)，陽(yáng)性率大于50%計(jì)為(+++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)分別用0、1、2、3分表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUC-MSCs純度和外周血單個(gè)核細(xì)胞B細(xì)胞比例

流式細(xì)胞儀檢測(cè)第三代hUC-MSCs表面CD44和CD31表達(dá)分別為99.8%和1.6%。流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康供者、rITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD19標(biāo)記的細(xì)胞分別為6.9%和6.2%(圖1、2)。

B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞分泌抗體與PWM濃度和作用時(shí)間的相關(guān)性

PWM濃度30、10、1 mg/L，作用4 d時(shí)健康供者組IgG分泌量分別為(4.83±0.17)、(3.49±0.66)、(2.97±0.88)μg/L，分別高于同濃度第2天、第7天IgG分泌量(P均<0.01)；IgM分泌量分別為(3.47±0.49)、(1.84±0.46)、(1.67±0.65)μg/L，高于同濃度第2天、第7天IgM分泌量(P均<0.01)(圖3)，因此以PWM為30 mg/L、4 d作為PWM刺激B細(xì)胞的濃度和時(shí)間。該刺激條件下rITP患者組IgG分泌量為(7.39±1.42)μg/L，高于健康供者組(P=0.014)；rITP患者組IgM分泌量為(5.44±0.17)μg/L，高于健康供者組(P=0.039)(表1)。選用PWM濃度為30 mg/L，作用時(shí)間4 d進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1hUC-MSCs純度鑒定

Fig1hUC-MSCs’ purity identification

hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；CD44標(biāo)記的hUC-MSCs細(xì)胞占99.8%；CD31標(biāo)記的hUC-MSCs細(xì)胞占1.6%

hUC-MSCs抑制抗體IgG、IgM的分泌

hUC-MSCs和rITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞以2∶10共培養(yǎng)時(shí)，rITP患者IgG、IgM分泌量分別是(4.98±1.63)和(3.78±0.82)μg/L，明顯低于無(wú)hUC-MSCs時(shí)IgG、IgM分泌量(P=0.005、0.003)。此比例時(shí)rITP患者組IgG、IgM分泌量和健康供者組無(wú)明顯差異(P=0.266、0.543)(表2)。

hUC-MSCs抑制Blimp- 1蛋白的表達(dá)

rITP患者CD138標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率即Blimp- 1蛋白表達(dá)率在hUC-MSCs∶單個(gè)核細(xì)胞為2∶10時(shí)為33.51%，較無(wú)hUC-MSCs時(shí)明顯下降(P=0.026)，與健康供者組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.076)(圖4)。

圖2外周血CD19標(biāo)記的細(xì)胞百分比

Fig2CD19 marked peripheral blood mononuclear cells

rITP：難治性免疫性血小板減少癥；健康供者組外周血CD19標(biāo)記細(xì)胞為6.9%； rITP患者組外周血CD19標(biāo)記細(xì)胞為6.2%

圖3健康供者外周血在不同PWM濃度及不同作用時(shí)間時(shí)IgG、IgM分泌量

Fig3IgG and IgM secretion levels of healthy donors with different PWM concentration and work time

PWM：美洲商陸

表1不同PWM濃度時(shí)健康供者組及rITP患者組IgG、IgM的分泌量
Table1IgG and IgM secretion levels of healthy donors and rITP patients with different PWM concentration

PWM(mg/L)健康供者rITP患者IgGIgMIgGIgM　1　　　297±088△　　　167±065△　　　465±087△　　　276±112△10　　　349±066#　　　184±046△　　　497±067△　　　259±053△30　　　483±017　　　347±049　　　739±142?　　　544±017?

PWM：美洲商陸；rITP：難治性免疫性血小板減少癥；與健康供者比較，*P<0.01；與PWM 30 mg/L比較，#P<0.05，△P<0.01

表2rITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞與hUC-MSCs不同比例及無(wú)hUC-MSCs時(shí)IgG、IgM分泌量
Table2IgG and IgM secretion levels of rITP patients with no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio

hUC?MSCs：PBMCIgGIgM無(wú)hUC?MSCs　　739±142　　544±01705∶10　　724±144　　564±0961∶10　　670±061　　528±1052∶10　　498±163?　　378±082?4∶10　　680±187　　533±0708∶10　　707±112　　603±116

rITP：難治性免疫性血小板減少癥；hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞；與無(wú)hUC-MSCs比較，*P<0.01

圖4　健康供者組、rITP患者組無(wú)hUC-MSCs、外周血單個(gè)核細(xì)胞與hUC-MSCs不同比例時(shí)Blimp- 1蛋白表達(dá)率Fig 4　Blimp- 1 protein expression of healthy donors,no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio of rITP patientsrITP：難治性免疫性血小板減少癥；hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；Blimp- 1：B細(xì)胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1; PBMC：外周血單個(gè)核細(xì)胞

討　　論

MSCs是全能干細(xì)胞，可以從骨髓、臍帶、脂肪等組織中提取，有自我更新、分化的能力。有易于分離提取、特異性表面標(biāo)記、可分化為多種細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)、遷移等特性，因此MSCs可用于治療再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病。MSCs具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能[7]。目前認(rèn)為MSCs通過(guò)可溶性因子[8]、白細(xì)胞介素10(interleukin- 10, IL- 10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)[9]、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化增殖。MSCs使B 細(xì)胞停滯在G0/G1期、改變B細(xì)胞胞外激酶和p38促分裂原活化蛋白的激發(fā)模式[10]，使B 細(xì)胞不能增殖分化為漿細(xì)胞，從而減少IgG、IgM、IgA的分泌。我們的實(shí)驗(yàn)中，hUC-MSCs高表達(dá)CD44，不表達(dá)CD31，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)相同，而且hUC-MSCs比其他組織來(lái)源的MSCs更原始，更具有增殖分化能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在hUC-MSCs∶單個(gè)核細(xì)胞為2∶10時(shí)IgG、IgM分泌量較無(wú)hUC-MSCs時(shí)明顯減少，與相關(guān)文獻(xiàn)[11]一致。說(shuō)明hUC-MSCs可以抑制B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞。

Blimp- 1是由prdm1基因編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以誘導(dǎo)成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)育為漿細(xì)胞，被稱作“B淋巴細(xì)胞終極分化的主調(diào)控子”。成熟B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞需多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共同參與，其中PAX5、BCL- 6、MITF、MTA3、BACH2參與B細(xì)胞分化，Blimp、XBP- 1、IRF- 4參與漿細(xì)胞分化。Asari等[12]認(rèn)為將B細(xì)胞和MSCs共培養(yǎng)可抑制Blimp- 1 mRNA的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)也證明hUC-MSCs和B 細(xì)胞共培養(yǎng)，Blimp- 1蛋白表達(dá)下降，從而減少B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。

本實(shí)驗(yàn)中，hUC-MSCs對(duì)IgG、IgM及Blimp- 1蛋白的抑制程度，并不和其濃度成正比，這和Bertolo等[13]的實(shí)驗(yàn)相似，Bertolo等在體外將人MSCs和人椎間盤組織共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人MSCs 50 000個(gè)/孔時(shí)對(duì)IgG的抑制率反而低于人MSCs為10 000/孔時(shí)的抑制率。有學(xué)者認(rèn)為人MSCs對(duì)B細(xì)胞的活性無(wú)影響，但抑制B細(xì)胞的增殖，使其停滯在G0/G1期[11]。本研究未進(jìn)行B細(xì)胞增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于hUC-MSCs是否使B細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期某一時(shí)期還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hUC-MSCs可以抑制Blimp- 1蛋白從而抑制rITP患者外周血B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，減少IgG、IgM的分泌，為臨床骨髓移植治療rITP提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其他作用機(jī)制及臨床治療劑量仍需探索。

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