苗　青，許　巍，皇惠杰，侯曉玲，朱　康，劉永革，關　輝，王　燕，李　珍，任亦欣，向　莉

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院過敏反應科， 北京 100045)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(4)：313- 319

過敏性鼻炎和支氣管哮喘均為兒童常見的氣道過敏性疾病，其病理損傷為氣道慢性炎癥反應[1]，雖然這兩種疾病的病理損傷解剖部位分屬上下氣道，但由于氣道管腔黏膜相連并延展組成了一個結構相似的“連續(xù)體”，致使上下氣道成為一個統(tǒng)一功能體，故使兩種疾病在發(fā)病機制、臨床表型、治療管理方面密不可分[2]。我國城市兒童哮喘流行病學調查結果顯示：在確診的哮喘患兒中50.1%伴有過敏性鼻炎[3]。

以往認為，過敏性鼻炎、支氣管哮喘等氣道過敏性疾病的發(fā)生與機體輔助性T細胞(T helper cell，Th)1/Th2免疫應答失衡相關[4]。隨著近年來對疾病表型和內表型的深入研究，發(fā)現(xiàn)體內存在另一類不同于Th1、Th2的新型輔助性T細胞亞群——Th17細胞，后者通過分泌大量的白細胞介素(interleukin，IL)- 17家族細胞因子，在啟動并維持氣道炎癥過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[5]。已證實哮喘患者支氣管肺泡灌洗液、痰、血漿中Th17細胞及其IL- 17水平顯著升高，且與哮喘控制水平呈負相關關系[6- 7]。此外，已證實Th17細胞還可以刺激氣道上皮細胞分泌大量IL- 8，IL- 8是強效的中性粒細胞趨化因子，可導致以中性粒細胞募集和活化為特點的氣道炎癥發(fā)生。由于Th17細胞與經(jīng)典Th2細胞介導嗜酸粒細胞增多為特點的氣道炎癥差異較大[8]，故導致這兩類患者臨床表型也存在較大差異[9- 10]。

雖然Th17細胞亞群的發(fā)現(xiàn)對于闡述氣道過敏性疾病的免疫病理學機制起到了一定的補充作用，但相較于單純哮喘患兒、單純過敏性鼻炎患兒,臨床常見的大部分哮喘并發(fā)鼻炎患兒是否存在Th17細胞及其相關細胞因子介導的免疫應答差異目前尚不十分清楚。本研究通過比較哮喘、鼻炎、哮喘并發(fā)鼻炎患兒及健康兒童間外周血Th17細胞免疫應答差異，希望能夠對深入了解Th17細胞在兒童氣道過敏性疾病中的免疫調節(jié)作用起到一定幫助作用。

資料和方法

對象和分組

本研究共設哮喘組、哮喘并發(fā)過敏性鼻炎組、鼻炎組和健康對照組4組。患者入組標準：(1)所有支氣管哮喘患者診斷均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組制訂的診斷標準，過敏性鼻炎診斷標準參考中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組制定的診斷和治療指南[11- 12]；(2)所有入組患兒經(jīng)體外過敏原半定量篩查方法(Mediwiss，德國)判定為粉塵螨或戶塵螨過敏原陽性反應(包括多重陽性致敏患兒，但其他過敏原致敏級別均低于塵螨致敏級別)。排除標準：(1)近4周內有呼吸道感染者；(2)近3個月內使用過口服或靜脈應用糖皮質激素和其他免疫抑制劑者；(3)并發(fā)其他心肺疾病者或患有呼吸系統(tǒng)其他疾?。?4)正在進行或近3年接受過特異性免疫治療者。存在上述任一情況者均排除。

健康對照組兒童為同期在本院保健中心查體的年齡、性別匹配的健康體檢兒童。入組標準：(1)無過敏性鼻炎、過敏性哮喘、食物過敏等過敏性疾病史；(2)皮膚點刺試驗和體外過敏原半定量篩查方法(Mediwiss，德國)判定為粉塵螨或戶塵螨過敏原陰性反應。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，家長均知情同意。

試劑與儀器

FITC標記大鼠抗人CD4單克隆抗體、PE標記小鼠抗人IL- 17單克隆抗體及其匹配的同型對照抗體，細胞固定破膜劑(Fixation/Permeabilization Solution)均購自美國ebioscience公司。佛波酯(phorbol ester，PMA)、離子霉素(Ionomycin)、莫能菌素(Monensin)均購自美國Sigma公司。人淋巴細胞分離液(Ficoll)購自上海博蘊生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。重組屋塵螨抗原蛋白1(dermatophagoides pteronyssinus1，Der p1)購自Indoor公司。人細胞因子IL- 17、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自R&D公司。所有實驗操作方法嚴格按產(chǎn)品說明書進行。FACS Calibur型流式細胞儀為美國貝克曼公司產(chǎn)品。

臨床資料和實驗室指標檢測

呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO)檢測：采用瑞典Aerocrine公司耐爾斯(NIOX)FeNO檢測系統(tǒng)，采用化學發(fā)光法進行檢測。受試者保持安靜狀態(tài)10 min以上，檢測前盡可能將肺內氣體呼出至功能殘氣位，用口含緊NIOX濾器，快速吸氣至肺總量位置，然后以均勻氣流將氣體呼出，維持10 s左右，通過氣流限速嘴使呼氣流速恒定在50 ml/s，使呼出氣達到一個穩(wěn)定的平臺期，保證流速的平臺持續(xù)時間至少3 s，流速穩(wěn)定在儀器限定的上下限范圍內。系統(tǒng)自動完成測定和分析計算，測定結果以×10-9表示。

肺功能參數(shù)測定：采用德國耶格公司生產(chǎn)的兒童肺功能儀。每次啟動肺量計時經(jīng)容量定標器定標。每次開機均采用體溫(37 ℃)、標準大氣壓(101.08 kPa)、飽和水蒸氣的氣體狀態(tài)(BTPS)進行校正。測試參考美國胸科學會(American Thoracic Society，ATS)標準，由操作熟練的技師完成。要求受試者取坐位并坐直，雙腳著地，頭保持自然水平。上鼻夾，用唇緊密包繞咬口器，舌頭不能堵塞咬口器，保證口鼻不漏氣，避免過緊的腰帶、胸帶和衣服等。測試前先讓受試者練習1～2次。至少測定3次，最佳兩次間誤差少于5%，且流速容量曲線無異常，時間容量曲線示呼氣相出現(xiàn)平臺。取最佳值作為記錄參數(shù)。

外周血嗜酸粒細胞計數(shù)：常規(guī)采集無名指端血，采用五分類血細胞全自動分析計數(shù)儀檢測嗜酸粒細胞。

外周血單個核細胞分離

抽取入選研究對象的外周肝素抗凝靜脈血2 ml，全血離心后收集血漿于-80 ℃凍存待測，剩余標本經(jīng)人淋巴細胞分離液(Ficoll)密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調整PBMC密度至2×106個/ml，懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素)。

外周血Th1及Th17細胞及相關細胞因子檢測

取PBMC懸液(2×106個/ml)加入96孔培養(yǎng)板內，將每例患兒的PBMC細胞懸液分為3孔，每孔0.2 ml，分別給予重組Der p1(20 μg/ml)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(37 ℃、5% CO2)，培養(yǎng)最后5 h加入PMA(50 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)以及高爾基體阻斷劑莫能霉素(4 μmol/L)后繼續(xù)培養(yǎng)。收集細胞后分為同型對照管和實驗管，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)-CD4熒光標記抗體0.5 μl，避光室溫孵育30 min后洗滌棄上清。嚴格按照試劑盒說明書對細胞進行固定和破膜步驟破膜，加入PE-IFN-γ或PE-IL- 17A抗體，各組均設同型對照，室溫避光孵育60 min。洗滌后重懸細胞于300 μl緩沖液中待上機檢測。用標準微球校正儀器后，打開CellQuest軟件，利用CD4/側向角散射光(slide scatter, SSC)設門，分別以CD4+IFN-γ+和CD4+IL- 17A+表示Th1細胞和Th17細胞，計算CD4+細胞中Th1細胞亞群和Th17細胞亞群所占比例(%)，所有流式數(shù)據(jù)應用FlowJo軟件進行分析。

收取上述凍存血漿和PBMC培養(yǎng)上清液，應用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測細胞因子IL- 17A、IL- 17E、IL- 17F水平，按照試劑盒說明書進行操作，每個樣本和標準品均設3個復孔。

統(tǒng)計學處理

結　　果

研究對象一般資料

本研究共入組罹患氣道過敏性疾病患者133例，其中哮喘組患兒41例：男20例，女21例，平均年齡(12.4±4.4)歲；鼻炎組患兒40例：男19例，女21例，平均年齡(14.0±5.2)歲；哮喘并發(fā)鼻炎組患兒52例：男32例，女20例，平均年齡(13.5±6.1)歲。另外設立健康對照兒童45例：男27例，女18例，平均年齡(12.7±4.5)歲。四組研究對象年齡、性別和體質量指數(shù)等差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。肺功能參數(shù)、嗜酸粒細胞以及FeNO等臨床指標四組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，進一步就上述三項指標在哮喘組、哮喘并發(fā)鼻炎組、鼻炎組患兒間進行組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(表1)。

外周血Th1和Th17細胞亞群所占比例比較

采用流式細胞術檢測外周血Th1細胞、Th17細胞所占比例(圖1)。外周血Th1細胞亞群在哮喘并發(fā)鼻炎組、鼻炎組和哮喘組中所占比例分別為13.2%±5.3%、12.2%±6.7%和12.1%±4.1%，均低于健康對照組(17.0%±5.1%)，四組間Th1細胞亞群比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。未觀察到哮喘組、鼻炎組、哮喘并發(fā)鼻炎組三組患兒間Th1細胞亞群存在組間統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。外周血Th17細胞比例分別為哮喘并發(fā)鼻炎組1.8%±0.7%、哮喘組1.2%±0.5%、鼻炎組1.1%±0.6%以及健康對照組0.5%±0.4%，四組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。哮喘組、鼻炎組、哮喘并發(fā)鼻炎組三組患兒間Th17細胞亞群差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表2)。

外周血及PBMC培養(yǎng)上清中Th17細胞相關細胞因子水平比較

健康對照組相比，三組患兒外周血IL- 17A、IL- 17E水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。僅觀察到IL- 17E水平在哮喘組、哮喘并發(fā)鼻炎組、鼻炎組三組患兒間存在差異，其中哮喘并發(fā)鼻炎患兒最高[(19.2±10.4)pg/ml]，其次為鼻炎組[(18.1±9.2)pg/ml]、哮喘組[(17.4±9.1)pg/ml]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。體外水平經(jīng)塵螨蛋白抗原刺激后，哮喘并發(fā)鼻炎組、哮喘組、鼻炎組患兒PBMC培養(yǎng)上清中IL- 17E水平較刺激前均顯著升高(均P<0.05)，而對健康對照組未造成影響(表4)。

外周血Th17細胞及IL-17E水平與嗜酸粒細胞、FeNO指標間相關性分析

相關性分析發(fā)現(xiàn)，僅哮喘并發(fā)鼻炎組患兒外周血Th17細胞比例與FeNO水平、外周血嗜酸粒細胞胞計數(shù)呈正相關關系(P<0.05)。哮喘并發(fā)鼻炎組、哮喘組、鼻炎組患兒外周血血漿IL- 17E水平與FeNO水平、外周血嗜酸粒細胞計數(shù)亦存在正相關關系(均P<0.05)(表5)。

表1　研究對象一般資料比較Table 1　Comparison of demographic and clinical characteristics among enrolled subjects

圖1流式細胞術檢測PBMC中Th1及Th17細胞在CD4+T細胞所占比例

Fig1Detection the percentage of Th1 cells(CD4+IFN-γ+T) and Th17 cells(CD4+IL17-A+T) of CD4+T in peripheral blood by FCM

A：PBMC分析設門；B：PBMC經(jīng)PMA/ionomycin刺激培養(yǎng)4 h后，CD4+細胞膜表面CD25表達水平；C：胞內表達IFN-γ的CD4+細胞比例(%)；D：胞內表達IL- 17A的CD4+細胞比例(%)

表2　外周血Th1及Th17細胞所占比例比較Table 2　Comparison of percentage of Th1 cells and Th17 cells in CD4+T cells among four groups　(x±s，%)

HC：健康對照組; AS：哮喘組；AR：鼻炎組；ASR：哮喘并發(fā)鼻炎組；a四組研究對象間(HC組、ASR組、AS組、AR組)比較；b三組患兒間(ASR組、AS組、AR組)比較

表3　外周血血漿中Th17細胞相關細胞因子水平比較Table 3　Level of Th17 cell related cytokine in plasma　(x±s,pg/ml)

HC：健康對照組; AS：哮喘組；AR：鼻炎組；ASR：哮喘并發(fā)鼻炎組；a四組研究對象間(HC組、ASR組、AS組、AR組)比較；b三組患兒間(ASR組、AS組、AR組)比較

表4PBMC培養(yǎng)上清中Th17細胞相關細胞因子水平比較
Table4Level of Th17 cell related cytokine in HDM activated PBMC supernants

分組IL-17AIL-17EIL-17F刺激前刺激后P值刺激前刺激后P值刺激前刺激后P值HC10.0±5.411.7±6.80.10512.8±6.411.4±4.10.2406.8±4.87.6±3.90.504AS12.6±8.214.2±5.90.41717.2±7.223.5±7.20.00413.4±8.312.3±9.80.355AR14.6±6.017.4±5.60.29814.2±10.817.7±9.30.00311.8±5.812.6±11.50.515ASR15.5±4.416.7±4.40.31615.8±9.825.46±9.020.00116.9±8.516.1±11.10.129

HC：健康對照組; AS：哮喘組；AR：鼻炎組；ASR：哮喘并發(fā)鼻炎組

討　　論

過敏性鼻炎和支氣管哮喘均屬于兒童期常見的氣道過敏性疾病，由于兩種疾病在病因學、發(fā)病機制和病理改變等方面具有很多相似之處，不僅可并發(fā)于同一患者，兩種疾病還互為風險因素相互影響，病情具有一定關聯(lián)性。早在2001年世界衛(wèi)生組織公布了“過敏性鼻炎及其對哮喘的影響”(allergic rhinitis and its impact for asthma，ARIA)指南后，明確提出過敏性鼻炎和哮喘是“同一個氣道，同一疾病”的觀念，提出了兩種疾病同時存在情況下的處理原則，并強調了兩者在許多方面均存在相關性[13]。

表5　外周血Th17細胞及IL- 17E水平與EOS、FeNO指標間相關性分析Table 5　Correlation analysis among Th17 cell and its cytokine, FeNO level and peripheral EOS

ASR：哮喘并發(fā)鼻炎組；AS：哮喘組；AR：鼻炎組；FeNO：呼出氣一氧化氮水平；EOS：外周血嗜酸粒細胞

“Th1/Th2”免疫失衡理論的提出，揭示了Th在氣道過敏性疾病免疫病理學機制中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用，不同效應T細胞亞群間相互聯(lián)系、相互牽制所組成的動態(tài)平衡網(wǎng)絡，對于維持機體的免疫自穩(wěn)狀態(tài)起到了積極意義[14]。Th17細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細胞亞群，可通過分泌IL- 17家族細胞因子參與自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病及病理過程。已證實：Th17細胞可作用于氣道不同靶組織細胞(如氣道上皮細胞、平滑肌細胞等)進而分泌大量中性粒細胞趨化因子(如IL- 8等)，最終形成以中性粒細胞募集為主的哮喘氣道炎癥表型[15- 16]。更為值得注意的是，與其他CD4+T細胞亞群相比，Th17細胞具有更高的分化可塑性特點(differential plastic)，即在特殊條件下,已分化成熟的Th17細胞可再次向其他譜系分化[17- 18]。Lee等[19]對患有幼年特發(fā)性關節(jié)炎的患兒關節(jié)滑液中各種CD4+T細胞亞群組成進行分析，發(fā)現(xiàn)存在一部分高表達CD161分子的非經(jīng)典型Th1細胞，CD161分子是Th17細胞的特征性分子標志，分析產(chǎn)生此種“Th1/Th17細胞”的原因是在Th17細胞分化后期,其表面表達IL- 12Rβ2分子,能夠應答炎癥局部Th1型極化因子IL- 12信號,驅動細胞核內Th1型轉錄因子T-bet的表達。張海龍等[20]研究對強直性脊柱炎患者機體Th1/Th17細胞比例進行分析，發(fā)現(xiàn)Th1/Th17平衡關系不僅與病情嚴重程度相關，且Th1與Th17細胞亞群之間存在相互拮抗的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，哮喘并發(fā)鼻炎組、鼻炎組和哮喘組患兒外周血Th1細胞亞群比例均顯著降低；而Th17細胞在哮喘組、鼻炎組、哮喘并發(fā)鼻炎組患兒均顯著升高，其中哮喘并發(fā)鼻炎組患兒外周血Th17細胞比例升高最為明顯，提示較單純罹患哮喘或過敏性鼻炎患兒，臨床上常見的哮喘并發(fā)鼻炎患兒群體，亦存在由Th17細胞介導的免疫應答反應，且Th17細胞與其他T細胞亞群(如Th1細胞亞群)之間的動態(tài)平衡關系，可能對于啟動和維持氣道炎癥反應起到了重要的調節(jié)作用。

本研究還對患兒外周血中Th17細胞相關細胞因子水平進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，哮喘組、鼻炎組以及哮喘并發(fā)鼻炎組患兒組外周血IL- 17A、IL- 17E水平均顯著性升高。體外水平給予塵螨過敏原蛋白刺激后，可以有效刺激哮喘組、鼻炎組以及哮喘并發(fā)鼻炎組三組患兒PBMC分泌IL- 17E因子的能力，而對健康對照組兒童未造成影響，上述結果均提示：Th17細胞及其分泌的前炎癥因子IL- 17E在哮喘、過敏性鼻炎等氣道過敏性疾病中發(fā)揮了重要的免疫調節(jié)作用。IL- 17E，又名IL- 25，雖然同屬于IL- 17細胞因子超家族，但是由于與其他成員因子同源性較低，決定其生物學功能較其他家族成員也具有明顯差異。Fort等[21]在哮喘小鼠動物實驗模型中證實，靜注IL- 17E可以有效誘導IL- 4、IL- 5和IL- 13基因表達，促進小鼠外周血中IgE、IgG水平升高，血液中嗜酸粒細胞數(shù)量增加，使得肺和消化道中均表現(xiàn)出嗜酸粒細胞浸潤、黏液分泌、上皮細胞化生等一系列Th2型炎癥免疫反應特點的出現(xiàn)，因此有學者提出：IL- 17E在啟動和維持放大Th2型氣道炎癥反應過程中起到了重要的調節(jié)作用。本研究通過進行相關性分析發(fā)現(xiàn)：哮喘組、鼻炎組和哮喘并發(fā)鼻炎組患兒外周血IL- 17E水平升高與Th2型炎癥反映指標(FeNO水平、外周血嗜酸細胞數(shù)目)之間存在的正相關關系，在一定程度上證實了IL- 17E在Th2型氣道炎癥反應中可能發(fā)揮重要的作用。此外，相關性分析結果還顯示僅哮喘并發(fā)鼻炎組患兒外周血Th17細胞數(shù)量升高與FeNO水平、外周血嗜酸粒細胞計數(shù)呈正相關，而在哮喘組、鼻炎組中未觀察到上述關系的存在，提示與單純哮喘組、單純鼻炎組相比，哮喘并發(fā)鼻炎組患兒存在著由Th17細胞介導的免疫應答差異，其發(fā)揮的免疫調節(jié)作用機制尚有待進一步深入探討。

綜上所述，本研究通過比較哮喘、鼻炎、哮喘并發(fā)鼻炎患兒間Th17細胞介導的免疫應答差異，初步探究Th17細胞在氣道過敏性疾病中所發(fā)揮的免疫調節(jié)作用。由于本研究設計為回顧性研究且入組例數(shù)較少，未來應繼續(xù)設計前瞻性研究，進一步明確Th17細胞在兒童氣道過敏性疾病病情發(fā)展、轉歸過程中所發(fā)揮的免疫調節(jié)作用。

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