吳永潔++張俞+++池永寬++王元素+++李莉

摘要：在貴州省典型巖溶地區(qū)采集22份野生白三葉（Trifolium repens）種子于溫室內(nèi)栽培，以觀測其形態(tài)特征多樣性，探索白三葉的形態(tài)學(xué)差異與地理環(huán)境的關(guān)系。結(jié)果表明：貴州白三葉形態(tài)多樣性豐富，形態(tài)特征變異大小為：匍匐莖長度>中葉面積>地上生物量>生長點個數(shù)>有無“V”形斑紋>株高>中葉寬>中葉長>生長習(xí)性。不同海拔地區(qū)白三葉的形態(tài)性狀均具有廣泛的變異，不同性狀的變異程度也不同。聚類分析將22份材料分為3類。為進一步開展白三葉遺傳多樣性研究，選育出適應(yīng)喀斯特特殊生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良白三葉品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：貴州；白三葉；形態(tài)學(xué)；多樣性；巖溶地區(qū)

中圖分類號： S326；S181文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0291-06

收稿日期：2015-08-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31260115）；貴州省科技廳社發(fā)項目（編號：黔科合SY字（2012）3170）；貴州省重大科技攻關(guān)專項（編號：黔科合重大專項字[2011]6009號）；貴州省自然科學(xué)基金（編號：黔科合[J]2009-2091）。

作者簡介：吳永潔（1991—），女，廣西貴港人，碩士研究生，研究方向為草地生態(tài)學(xué)。E-mail：wuyjiekaobo@163.com。

通信作者：李莉，博士，副教授，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：liligznu@163.com。在家畜放牧采食等干擾下，草地植物會發(fā)生相應(yīng)的進化。短期干擾下植物發(fā)生生理反應(yīng)以應(yīng)對組織被采食后碳水化合物供給和光的不足；長期則發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化，進化“回避”采食機制以減少被采食的機會而持久存在[1]?！盎乇堋笔侵笢p少被采食的可能性和強度，主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)特性、物理特性等變化，形態(tài)特征多樣性高[2]。貴州省于1905年引進白三葉（Trifolium repens）種植，后逸生為野生種[3]，廣泛分布于全省66個縣市，占全省總縣市的79.5%[4]，白三葉已經(jīng)成為貴州最主要的豆科牧草。經(jīng)過100多年的進化，其形態(tài)特征發(fā)生了進化響應(yīng)。開展貴州野生白三葉株高、匍匐莖長度、“V”形斑紋等表型特征的研究，探討其形態(tài)多樣性的進化機制，對合理開發(fā)利用和保護白三葉種質(zhì)資源，進一步選育出適應(yīng)喀斯特特殊生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良品種有積極的理論與現(xiàn)實意義。

1材料與方法

1.1貴州地理與氣候

試驗在貴州省花溪區(qū)貴州牧草推廣站溫室進行，種子收集于貴州省各地。貴州屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，四季分明，平均氣溫在15 ℃左右，由于緯度較低，許多地區(qū)的氣候冬無嚴寒，夏無酷暑，最冷的1月份平均溫度在3～8 ℃之間，而最熱的7月份平均溫度也在18～26 ℃之間。貴州省由于受季風(fēng)影響，冷暖氣流交匯頻繁，年降水量在1 100～1 300 mm之間，但降水季節(jié)分配不均，80%的雨水都集中在5—10月份。貴州省的地勢起伏較大，地形也較復(fù)雜，導(dǎo)致氣溫的垂直變化十分明顯，氣候類型多樣。

1.2材料收集

2013年5—8月在貴州省范圍內(nèi)采集野生白三葉種子，有效材料22份，詳見表1。

1.3栽培與觀測

1.3.1溫室栽培于2014年3月20日在貴州省牧草推廣站溫室大棚播種。播種前種子進行低溫處理破除硬實。培養(yǎng)基質(zhì)按m石英砂 ∶m細土 ∶m腐殖質(zhì)=3 ∶4 ∶3混合而成，高壓滅菌后冷卻裝盤。播入32格種苗培養(yǎng)盤，育苗盤大小54 cm×28 cm，孔穴大小60 mm×60 mm。為保證出苗率，每格播10粒種子，覆土1 cm，澆透水。等長出小苗后留選出長勢最好的1株苗。

1.3.2施肥管理苗期施尿素1次，使用量折合 0.012 kg/m2。以后隔3個月施復(fù)合肥1次，每次施用量 0.03 kg/m2。及時除雜，適時澆水。

1.3.3測量指標(biāo)2014年9月1日觀測“V”形斑紋、葉面積、株高、中葉寬、中葉長、匍匐莖長度、生長點個數(shù)，2014年10月3日測定地上生物量等。

為便于分析，將非量化性狀特征進行標(biāo)準化賦值。有無“V”形斑：有斑=1，無斑=2；海拔：1=500 m以下，2=501～1 000 m，3=1 001～1 500 m，4=1 501～2 000 m，5=2 001 m以上；生長習(xí)性：1=直立生長，2=匍匐分枝生長，3=匍匐不分枝生長。

1.4數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，分析種內(nèi)、種間各個性狀的差異程度。用Person相關(guān)系數(shù)分析各個性狀之間的相關(guān)性，并對各個指標(biāo)標(biāo)準化后用算術(shù)平均法（UPGMA）進行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1白三葉形態(tài)學(xué)分析

2.1.1白三葉形態(tài)學(xué)性狀差異分析貴州省不同種質(zhì)資源表1試驗材料

間的白三葉在形態(tài)上存在較大差異，表現(xiàn)出顯著的形態(tài)多樣性（表2和表3）。白三葉種內(nèi)差異顯著，9個形態(tài)特征之間的變異系數(shù)都在20%以上。匍匐莖長度變異系數(shù)最大，達86.60%，變異范圍為1.00～87.00 cm。其余形態(tài)特征變異大小為：中葉面積>地上生物量>生長點數(shù)>有無“V”形斑紋>株高>中葉寬>中葉長>生長習(xí)性，生長習(xí)性最小，為 20.23%。

2.1.2不同地理位置白三葉形態(tài)學(xué)差異分析7個數(shù)量形態(tài)性狀的分析結(jié)果（表4）表明，不同海拔地區(qū)白三葉的形態(tài)性狀均具有廣泛的變異，不同性狀的變異程度也不同?？傮w上，株高、地上生物量及中葉面積隨著海拔升高而呈現(xiàn)下降趨勢，生長點數(shù)及匍匐莖長度隨海拔升高呈上升趨勢。

在海拔低于500 m的區(qū)域，白三葉總變異系數(shù)高達 252.31%，其中匍匐莖長度呈現(xiàn)出顯著的差異，變異系數(shù)為80.56%，最長為20.00 cm，最短只有2.00 cm。其次是地上生物量、生長點數(shù)、中葉面積、株高、中葉寬、中葉長，其變異系數(shù)分別為47.96%、46.48%、25.35%、20.34%、1656%、15.05%。

在海拔為501～1 000 m的區(qū)域，白三葉匍匐莖長度的變異程度最大，達90.19%，變異范圍為1.00～87.00 cm，其平均長度為12.84 cm；其中最長的是W6（臺江縣臺供鎮(zhèn)南市村，21.54 cm），最短的是W7（德江縣煎茶鎮(zhèn)，4.06 cm）。其余變異大小為生長點數(shù)>地上生物量>中葉面積>株高>中葉寬>中葉長，它們的變異系數(shù)分別為51.23%、50.00%、42.86%、25.21%、22.00%、20.99%。

在海拔為1 001～1 500 m的區(qū)域，白三葉總變異系數(shù)為298.21%，其中匍匐莖長度的變異系數(shù)最大，為78.21%，變化范圍為2.00～62.00 cm，其總平均長度為15.60 cm，其中最長的是W16（興仁縣真武山街道辦事處三村叉河組，19.33 cm），最短的是W17（望謨縣打易鎮(zhèn)毛坪村上打鬧灣組，5.50 cm）。其余變異大小為地上生物量>生長點數(shù)>中葉面積>株高>中葉長>中葉寬，它們的變異系數(shù)分別為 70.34%、49.56%、35.63%、24.96%、20.39%、19.12%。

在海拔為1 501～2 000 m的區(qū)域，總變異系數(shù)高達 329.38%，其中白三葉匍匐莖長度變異系數(shù)最大，為 84.56%，變異范圍為1.50～49.00 cm，其平均長度為13.54 cm，其中最長的是W21（赫章姑媽村，平均19.30 cm），最短的是W20（施秉縣城關(guān)鎮(zhèn)小河村，平均2.94 cm）。其余變異大小為地上生物量>生長點數(shù)>中葉面積>株高>中葉長>中葉寬，它們的變異系數(shù)分別為58.87%、53.38%、49.13%、33.02%、26.24%、24.18%。

在海拔高于2 000 m的區(qū)域，匍匐莖長度和地上生物量都呈極顯著差異，其變異系數(shù)分別為79.99%、61.78%，變異范圍分別為2～45 cm、0.07～4.49 g。其余變異大小為中葉面積>生長點數(shù)>株高>中葉長>中葉寬，其變異系數(shù)分別為47.29%、44.58%、32.76%、25.76%和25.00%。

2.2形態(tài)學(xué)性狀相關(guān)性分析

2.2.1形態(tài)學(xué)特性相關(guān)性分析供試材料主要形態(tài)學(xué)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見表5，各性狀間采用Person相關(guān)系數(shù)分析。結(jié)果表明，株高與中葉寬、中葉長、中葉面積及地上生物量呈極顯著正相關(guān)，與生長點個數(shù)、匍匐莖長度、生長習(xí)性呈極顯著負相關(guān)；生長點個數(shù)與匍匐莖長度、地上生物量、生長習(xí)性呈極顯著正相關(guān)，與中葉長、中葉寬、中葉面積呈極顯著負相關(guān)；匍匐莖長度與中葉長、中葉寬、中葉面積呈極顯著負相關(guān)，與地上生物量、有無“V”形斑紋呈極顯著正相關(guān)；中葉長、中葉寬、地上生物量兩兩呈極顯著正相關(guān)，同時，中葉長、中葉寬還與有無“V”形斑紋呈極顯著負相關(guān)，地上生物量與生長習(xí)性呈極顯著正相關(guān)；中葉面積與有無“V”形斑紋呈極顯著負相關(guān)。分析說明白三葉植株越高，中葉長寬、中葉面積都較大，地上生物量也越高，而生長點個數(shù)越少，偏向于直立生長。生長點個數(shù)越多，則匍匐莖越長，中葉的長寬及面積都越小，偏向于匍匐不分枝生長。匍匐莖越長，則地上生物量越大，偏向于無斑的匍匐不分枝生長。

2.2.2形態(tài)學(xué)特性與地理分布的相關(guān)性分析海拔與株高、中葉寬、中葉長及中葉面積呈極顯著負相關(guān)，與匍匐莖長度呈顯著正相關(guān)，地上生物量與海拔高度呈顯著負相關(guān)。表明隨著海拔提高，白三葉長得越矮小，中葉長、寬、面積也越小，地上生物量也隨海拔高度提升而減少。總體上，在高海拔地區(qū)，植株較矮小，匍匐莖較長，在低海拔地區(qū)，植株較高，匍匐莖較短。而生長習(xí)性、有無“V”形斑紋與海拔高度無顯著相關(guān)性。

2.3聚類分析

以株高、中葉長、中葉寬、中葉面積、生長點數(shù)、匍匐莖長度、地上生物量、海拔、生長習(xí)性等作為表觀形態(tài)性狀指標(biāo)，標(biāo)準化后對22份白三葉材料進行聚類分析，聚類方法選用類平均法，距離測度采用歐氏距離。聚類分析如圖1所示。

從種質(zhì)資源水平上說，先聚到一起的種質(zhì)材料之間的親緣關(guān)系較近，即距離測度越近，親緣關(guān)系越近。聚類分析（圖1）表明，大部分來源地域距離鄰近的種質(zhì)材料先聚到一塊，說明它們的親緣關(guān)系較近。在歐氏距離為15.0處，將22份材料聚為3類。第1類：W1和W20聚為一類，植株最高（其平均值分別為14.80、15.58 cm），匍匐莖較短，中葉面積也最大，大多有斑；第2類：生長點數(shù)較多和匍匐莖也較長，地上生物量也較大的材料W15、W6、W13、W16、W22、W12、W10、W5、W8、W21、W11、W3、W18聚為一類。第3類：W19、W17、W4、W9、W2、W7及W14聚為一類，大多有斑紋，生長點數(shù)和匍匐莖長度介于第1類和第2類之間，地上生物量較小，少數(shù)直立生長。這說明，由于遺傳具有穩(wěn)定性，在同一環(huán)境中生長的不同種質(zhì)資源的白三葉在形態(tài)上也存在較大的差異。

3結(jié)論與討論

3.1白三葉的形態(tài)多樣性與進化

貴州野生白三葉形態(tài)差異較大，多樣性豐富。王玉祥等研究了來自新疆13份白三葉的表型性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)特征的變異系數(shù)在8.5%～24.75%之間[5]；何俊對國內(nèi)外62份白三葉草種質(zhì)資源形態(tài)多樣性進行了分析鑒定，其15個重要形態(tài)學(xué)性狀指標(biāo)變異系數(shù)范圍為14.32%～76.51%[4]；而本研究中白三葉9個形態(tài)特征的變異系數(shù)范圍比以上地區(qū)更廣泛，為20.32%～86.60%?？λ固厣絽^(qū)貴州畢節(jié)的12份野生燕麥的7個農(nóng)藝性狀遺傳多樣性的變異系數(shù)范圍為 9%～75%[6]，較新疆燕麥的1.7%～34.89%[7]和國內(nèi)外燕麥的11.29%～52.65%[8]變異范圍都大。從生物進化論看，任何物種都在隨生境條件的變化而變化；植物的形態(tài)特征受本身的遺傳組成和所生存環(huán)境的影響[5]，由于貴州省境內(nèi)海拔變化范圍廣，石漠化相當(dāng)嚴重，并在長期的自然選擇和人工選擇作用下，白三葉為適應(yīng)當(dāng)?shù)厣扯纬闪似涮赜械男螒B(tài)特征，因而具有豐富的形態(tài)多樣性。

3.2白三葉形態(tài)多樣性對環(huán)境的響應(yīng)

白三葉的形態(tài)多樣性與海拔等因素相關(guān)[9]，李州等研究表明，白三葉形態(tài)變異與地理起源存在較密切的相關(guān)性[10]。本研究的Person相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，白三葉的形態(tài)特征與海拔高度呈顯著相關(guān)，小葉白三葉主要分布于高海拔地區(qū)，大葉白三葉則分布于低海拔地區(qū)，這與Caradus等的研究結(jié)果[11-12]一致。植物的形態(tài)特征與其地理分布及其生境有關(guān)，孫雪梅等發(fā)現(xiàn)云南野生茶樹形態(tài)多樣性與其地理分布有關(guān)[13]，肖蘇等證明了川渝地區(qū)的野生鵝觀草的形態(tài)特征與其地理分布和生境存在一定的關(guān)系[14]。在不同的生境條件下，植物形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化，有利于適應(yīng)不同環(huán)境。白三葉形態(tài)變異大，形態(tài)可塑性大，生態(tài)適應(yīng)性越強。利用植物的表型特征對其進行相關(guān)研究，不僅可以初步了解植物遺傳變異水平，還可以研究其生物適應(yīng)和進化的方式、機制及其影響因子等[15]。貴州省白三葉形態(tài)多樣可能與貴州省特殊的喀斯特生態(tài)環(huán)境有關(guān)，還有待進一步研究，后續(xù)將進一步開展白三葉基因型多樣性的研究。

3.3白三葉形態(tài)特征與育種

貴州省白三葉形態(tài)特征豐富，是白三葉育種的重要基礎(chǔ)。在育種過程中可選擇差異較大的品種作為親本或重點研究對象，有望培育出植株高、匍匐莖長、生物量大的新品種。根據(jù)本研究結(jié)果，可利用海拔較低的區(qū)域，如碧江區(qū)川硐鎮(zhèn)、臺江

縣臺供鎮(zhèn)萬畝草場及松桃縣大興鎮(zhèn)等葉大且高的白三葉育種成為刈割型白三葉；在海拔較高的區(qū)域，如威寧板底村和赫章姑媽村等匍匐莖較長的白三葉適合培育成耐放牧的品種。但白三葉因其耐鹽堿、干旱能力差等原因致使其應(yīng)用受到了廣泛限制。目前，我國的白三葉育種工作還比較滯后，相關(guān)的研究報道還不多。安曉珂初步評價了新疆野生白三葉與三葉草屬其他種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系[16]，何俊研究了國內(nèi)外62份白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性[4]，王玉祥等研究了新疆13份野生白三葉表型性狀變異情況[5]，張賢等對白三葉RAPD分析條件進行了優(yōu)化[17]。因此，下一步工作可全面調(diào)查和收集國內(nèi)外野生白三葉資源，應(yīng)用分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段，增加其多樣性，擴大其基因庫，對合理開發(fā)和利用白三葉資源有重要的指導(dǎo)意義。

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