劉星++宋艷華+王芳++范志宇++胡波+++魏后軍++仇汝龍++徐為中+++薛家賓

摘要：通過體內(nèi)感染兔出血癥病毒后發(fā)現(xiàn)白介素6（Interleukin-6，IL-6）基因表達(dá)水平明顯升高。為體外研究IL-6啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，尋找該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本轉(zhuǎn)錄原件，首先利用染色體步移技術(shù)擴增得到兔[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的啟動子區(qū)序列，經(jīng)測序全長為763 bp；經(jīng)同源性分析，與人源[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的啟動子高度同源；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子序列含有AP-1、CREB/NF-IL6、NF-κB和TATA-box等轉(zhuǎn)錄元件。隨后將全長和一系列缺失體的IL-6啟動子基因（-400/+58 bp、-250/+58 bp、-170/+58 bp、-100/+58 bp）定向亞克隆至熒光素酶表達(dá)載體pGL3-Basic中，構(gòu)建了含有正確目的基因的報告基因重組體，然后瞬時轉(zhuǎn)錄RK-13細(xì)胞，利用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測。結(jié)果顯示，本試驗所克隆的[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子區(qū)具有明顯的活性，而且AP-1、CREB/NF-IL6和NF-κB在[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有著不可或缺的作用。以上結(jié)果為進一步研究兔[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：兔；[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因；啟動子；熒光素酶基因表達(dá)載體；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號： S858.291；Q785文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0031-04

收稿日期：2016-01-20

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20140740）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-44）。

作者簡介：劉星（1988—），男，江蘇南京人，博士研究生，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：iuxing88610@126.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機理及綜合防控技術(shù)等方面的研究。E-mail：rwangfang@126.com。

真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控包括DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)運過程、翻譯水平以及翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾等，而真核生物的基因表達(dá)調(diào)控多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄及以后的水平上，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究主要是啟動子區(qū)上的基本轉(zhuǎn)錄單位[1]。白介素6（Interleukin-6，IL-6）主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生。它可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長與分化，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性反應(yīng)及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。同時，IL-6在多種疾病狀況下有明顯改變。IL-6表達(dá)失調(diào)可引起許多疾病，其臨床表現(xiàn)主要為發(fā)病時IL-6水平增高。IL-6上升的水平與疾病的活動期、腫瘤的發(fā)展變化、排斥反應(yīng)程度以及治療效果都密切相關(guān)[2-3]。

兔體感染兔出血癥病毒后能明顯上調(diào)[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)水平，該基因水平的升高或許與其致病性相關(guān)[4]。為了研究兔源[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)調(diào)控，本試驗以兔IL-6為試驗對象，通過制備一系列[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子缺失突變體，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)確定其轉(zhuǎn)錄活性，以期尋求該基因啟動子區(qū)的核心啟動子區(qū)域，為啟動子功能進一步研究奠定基礎(chǔ)。同時，也為研究兔出血癥病毒調(diào)控[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗兔

選用2～3月齡健康易感新西蘭兔（未免疫兔出血癥及相關(guān)疫苗）10只（由金陵種兔場提供）分為2組（攻毒組和對照組），每組5只。

1.2種毒

攻毒用毒種為兔出血癥病毒皖阜株肝毒，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存[5]。病毒（含量105.5LD50/mL）攻毒劑量為1 mL；對照組選用PBS作為參照。

1.3肝臟病理變化分析和IL-6 mRNA水平的測定

攻毒后48 h，利用免疫組化法和蘇木精-伊紅染色法對攻毒組和對照組兔體肝臟組織進行病理變化分析，以及利用相對定量Real-time PCR對IL-6 mRNA表達(dá)水平進行測定，所用引物見表1。

1.4基因啟動子的克隆

新西蘭兔肝臟組織DNA采用苯酚-氯仿法提取[1]，用紫外分光光度計（260nm）檢測DNA 的完整性、純度和濃度。通過對GenBank中已收錄的人、鼠等物種的[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子進行同源性比對，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兔[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子克隆引物（表1），包括：[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子克隆引物IL-6-Fwd與IL-6-Rev1、IL-6-Rev2、IL-6-Rev3；啟動子缺失片段引物IL-6-Fwd-400、IL-6-Fwd-250、IL-6-Fwd-170和IL-6-Fwd-100。以兔基因組DNA 為模板，進行巢式PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×GC buffer（Mg2+）10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，LA Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，上下游引物（10 μmol/L）分別1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.8 μL。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，34個循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收，與PMD19-T載體16 ℃過夜連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。挑取白色菌落于液體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)質(zhì)粒PCR初步篩選陽性克隆后，送TaKaRa公司測序。

1.5[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子的生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的Blast對克隆所得的兔基因啟動子片段和人基因啟動子片段進行同源性比對；應(yīng)用Promoter 2.0 Prediction 軟件預(yù)測[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的啟動子區(qū)域。

1.6[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子缺失片段報告基因重組體的構(gòu)建

采用PCR方法從重組的[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子載體中克隆得到4個不同長度[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子缺失片段，上下游引物的5′端分別引入MluⅠ和BglⅡ酶切位點，引物見表1。擴增片段分別與 pMD19-T 載體進行連接，測序正確后進行 MluⅠ 和 BglⅡ雙酶切，回收酶切片段并連接到同樣酶切過的pGL3-Basic 載體的多克隆位點內(nèi)，構(gòu)建含[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因5′調(diào)控序列的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序進一步鑒定。

1.7細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL 的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)兔腎細(xì)胞RK-13。將RK-13在前1 d接種于24孔板，待細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合度時進行轉(zhuǎn)染[6]。

按照Roche 公司轉(zhuǎn)染試劑 FuGENE HD操作說明配制轉(zhuǎn)染混合物進行轉(zhuǎn)染。24孔板每孔轉(zhuǎn)染混合物：FuGENE HD 2 μL；DNA 0.5 μg（pGL3-IL-6 重組質(zhì)粒與 PRL-TK內(nèi)參照質(zhì)粒的質(zhì)量比為25 ∶[KG-*3]1）。同時設(shè)定 pGL3-Basic 載體轉(zhuǎn)染組（陰性對照組），啟動子不同片段的熒光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組（試驗組），每組設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。

1.8熒光素酶報告基因活性檢測

雙熒光素酶活性檢測按照雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)（Promega公司）操作說明進行。在轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)液，用1×PBS液洗滌細(xì)胞2次。每孔加入100 μL 1×PLB細(xì)胞裂解液，室溫孵育20 min充分裂解細(xì)胞。取20 μL裂解液加入96孔白板，然后加入LARⅡ100 μL，快速混勻后立即在BHP9504微孔板發(fā)光分析儀上檢測pGL3熒光素酶活性（F值）；再加入100 μL 1×Stop&Glo溶液檢測pRL-TK熒光素酶活性（R值）。以pGL3 熒光素酶活性與pRL-TK 熒光素酶活性的比值即相對熒光強度（relative luciferase activity，RAL）表示各組轉(zhuǎn)錄活性。計算各組F/R值，即熒光素酶的相對活性RAL。RAL 的數(shù)值為3次重復(fù)試驗的結(jié)果。

1.9數(shù)據(jù)分析

計量數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，運用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學(xué)分析方法采用t檢驗（P≤0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1肝臟組織病理變化及IL-6 mRNA表達(dá)水平測定

如圖1-A所示，相比于對照組，兔出血癥病毒感染兔體48 h以后，肝臟組織中能夠檢測到病毒，同時感染組會出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷，如肝臟細(xì)胞的崩解等；同時利用Real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)IL-6 mRNA水平明顯升高（圖1-B）。

2.2基因啟動子的克隆測序

以兔基因組DNA為模板，采用巢式PCR擴增，經(jīng)3次PCR擴增出約750 bp的特異性片段（圖2），將其基因啟動子PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體中，篩選陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序。測序結(jié)果表明，兔[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子PCR擴增片段長度為763 bp（圖3-A）。

[FK（W12][TPLX2.tif][FK）]

2.3[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子的生物信息學(xué)分析

經(jīng)Blast序列比對發(fā)現(xiàn)，克隆得到的[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因5′側(cè)翼序列與GenBank公布的人[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子相似性達(dá)90%以上。此序列包括轉(zhuǎn)錄起始位點（+1）上游714 bp；在線預(yù)測軟件分析表明，[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子具有典型的真核生物啟動子元件，如AP-1、CREB/NF-IL6、NF-κB和TATA-box等（圖3-B）。

2.4[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子缺失片段報告基因重組體的構(gòu)建和活性分析

如圖4-A所示，以含有[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子序列的PMD19-T載體為模板，克隆得到啟動子的不同長度缺失片段[CM（25]。不同長度的啟動子PCR產(chǎn)物經(jīng)MluⅠ和 BglⅡ雙酶切[CM）]

[FK（W39][TPLX3.tif][FK）]

后，與同樣進行雙酶切的pGL3-Basic載體進行連接，構(gòu)建啟動子報告基因重組體，經(jīng)測序正確。

將構(gòu)建好的[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子缺失片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)入內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK，通過檢測螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶活性的比值，來反映不同啟動子片段的活性。每次轉(zhuǎn)染均設(shè)陰性對照組。啟動子活性分析（圖4）表明，與轉(zhuǎn)染pGL3-Basic對照組相比，[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子報告基因重組質(zhì)粒pGL3-IL-6啟動子活性最高。pGL3-100活性最低。而pGL3-400、pGL3-250、pGL3-170和pGL3-100活性依次降低（圖4-B）。以上結(jié)果表明，AP-1、CREB/NF-IL6和NF-κB幾個轉(zhuǎn)錄元件在[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中均有著重要作用。

[FK（W21][TPLX4.tif][FK）]

3討論

白細(xì)胞介素-6（interleukelin-6，IL-6）是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，也是機體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，具有調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的作用[1]，在發(fā)生炎癥、壞死或由于腫瘤細(xì)胞抗原刺激免疫細(xì)胞分泌IL-6增高等情況下，血清中IL-6增加，過量表達(dá)IL-6往往與某些疾病相關(guān)。在兔出血癥病毒感染兔體后，會引起[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)量明顯升高，這或許與兔出血癥病毒的致病性有關(guān)[4，7]。

本研究主要利用基因步移技術(shù)克隆獲得IL-6的啟動子，為進一步分析[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。目前在研究真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)與功能時，主要應(yīng)用的是瞬時轉(zhuǎn)染法，瞬時轉(zhuǎn)染分析是將構(gòu)建好的外源DNA與雙報告基因的重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體導(dǎo)入（轉(zhuǎn)染）到特定細(xì)胞并使之表達(dá)，通過檢測報告基因的表達(dá)活性來確定所導(dǎo)入各片段的活性，從而確定目的基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的核心啟動子區(qū)。本研究克隆所得到兔[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子與人[WTBX][STBX]IL-6[WTBZ][STBZ]基因啟動子高度保守，尤其是AP-1、CREB/NF-IL6和NF-κB等幾個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件幾乎一致，進一步證實了我們克隆得到的該基因序列的準(zhǔn)確性[8]。經(jīng)缺失體構(gòu)建及啟動子活性分析表明，兔IL-6啟動子活性的調(diào)控與AP-1、CREB/NF-IL6和NF-κB有關(guān)[9-12]。AP-1和CREB/NF-IL6及NF-κB等元件已經(jīng)報道在人IL-6啟動子活性調(diào)控中也有著重要作用[13]。因此，該研究為深入了解IL-6調(diào)控機制，進一步探究兔出血癥病毒致病機制奠定了基礎(chǔ)。

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