于金迪，楊弘華，黃若儀，周思雨

(北京師范大學(xué) 珠海分校，廣東 珠海 519085)

液態(tài)條件下乳酸菌保存方法研究進(jìn)展

于金迪，楊弘華，黃若儀，周思雨

(北京師范大學(xué) 珠海分校，廣東 珠海 519085)

主要講述了乳酸菌的營養(yǎng)、維持腸道菌群平衡等方面的保健作用，同時(shí)總結(jié)了目前乳酸菌保存安全性最高，且應(yīng)用較為廣泛的方法，真空冷凍干燥保存法，對其優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)進(jìn)行了歸納。

乳酸菌；保存；冷凍

酸奶是用優(yōu)質(zhì)新鮮牛乳為主要原料，接入乳酸菌發(fā)酵后制成的一種發(fā)酵型乳制品[1]，其中可以添加全脂乳粉、脫脂乳粉或乳清粉等，但產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和乳酸菌含量要達(dá)到一定要求[2]，含有大量的蛋白質(zhì)、脂溶性維生素和鈣質(zhì)[3]。酸奶中的乳酸菌還可以合成B族維生素[4]，這些物質(zhì)在提供機(jī)體營養(yǎng)、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)[5]、維護(hù)腸道菌群的生態(tài)平衡[6-8]、促進(jìn)人體健康方面起著關(guān)鍵作用。

研究表明，在酸奶的營養(yǎng)保健功能中，乳酸菌起著舉足輕重的作用，可抑制有害菌繁殖，降低了有害物質(zhì)的濃度，降低癌變發(fā)生率[9-10]。乳酸菌的含量也是評(píng)價(jià)酸奶產(chǎn)品理化特性，及其營養(yǎng)保健作用的重要指標(biāo)[11-12]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)，是一群能分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，呈過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性菌[13]。大體上可分為兩類，一是動(dòng)物源乳酸菌，另一類是植物源乳酸菌[14]。

1 乳酸菌的生理功能

研究表明，它具有以下生理功能[15-18]：一、維持腸道菌群平衡。馬治宇[19]等人的研究表明，乳酸菌是腸道內(nèi)重要的優(yōu)勢菌群之一，優(yōu)勢菌群是維持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡的重要因素，它能夠定植于腸上皮，產(chǎn)生足夠多的乳酸使腸道pH環(huán)境趨于酸性，抑制在中、堿性環(huán)境中生長繁殖的腐敗菌，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，維持腸道微生態(tài)平衡和正常生理功能，優(yōu)勢菌群含量下降或失衡都將導(dǎo)致腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂或失衡[20]。Angela等人[21]通過探究也發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是腸道中的有益菌群，在阻抗?jié)撛谥虏【衅鸷诵淖饔?。二、促進(jìn)營養(yǎng)成分吸收。酸奶中乳酸菌可以合成大量B族維生素(如維生素B1、維生素B2、維生素B5、葉酸等)，還可以分解乳糖形成易于吸收的乳酸，乳酸的存在可大大增加人體對鈣、磷、以及鐵元素的吸收。三、增強(qiáng)機(jī)體免疫力。乳酸菌能誘導(dǎo)干擾素和促細(xì)胞分裂劑產(chǎn)生，產(chǎn)生免疫球蛋白抗體，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和免疫細(xì)胞對抗原的免疫活性，增強(qiáng)免疫能力，提高對癌癥的抵抗力。四、產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝物。李曉艷等人[7]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可產(chǎn)生具有抑菌效果的細(xì)菌素，細(xì)菌素是一種由細(xì)菌合成并分泌到環(huán)境中的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)，對多種革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)抑制作用，可以維護(hù)腸道菌群平衡。

2 乳酸菌的保存方法

乳酸菌不僅培養(yǎng)方式特殊，而且菌種保存方法也比較復(fù)雜，成活率不高。實(shí)驗(yàn)室通常采用液態(tài)或濕潤狀態(tài)下的固態(tài)保藏方法。但這種保存方法存在一定局限性，因?yàn)樵诒２剡^程中，乳酸菌仍能繼續(xù)生長，產(chǎn)生大量乳酸，使培養(yǎng)基的pH值下降而不利于其生長，最終導(dǎo)致菌體死亡。因此，如果采用這種方法保藏乳酸菌，要不斷地進(jìn)行傳代[22]。

目前，乳酸菌的保藏方法主要有四大類，分別是傳代法、干燥法、冷凍法以及冷凍干燥法。其中就目前而言，保存安全性最高且應(yīng)用較為廣泛的方法之一是真空冷凍干燥保存法[15]。

本綜述重點(diǎn)介紹真空冷凍干燥保存法。該方法的基本原理來自于熱力學(xué)中的相平衡理論：即一定的溫度和壓力條件下，水三種相態(tài)達(dá)到一個(gè)平衡。具體方法是：先對物料進(jìn)行預(yù)凍處理，使其中的水分完全凍結(jié)為冰晶，再使壓力低于三相點(diǎn)壓力，最后用熱量作為動(dòng)力除去物料中的水分[23]。

真空冷凍干燥過程通常包括三個(gè)主要階段，即預(yù)凍、升華、解析。其中預(yù)凍過程是先對物料進(jìn)行處理后，將裝盤放置在冷凍室中凍結(jié)，使物料中水分固化；升華過程則是把已經(jīng)凍結(jié)的物料處于真空條件下加熱，此時(shí)物料吸熱，內(nèi)部水分由于升華基本被除去；最后一個(gè)過程是解析，是直接加熱干燥物料，使其內(nèi)部的水分解析出來，進(jìn)一步降低物料的水分含量[23]。

乳酸菌發(fā)酵劑的工藝流程大致可分五個(gè)階段：篩選優(yōu)良菌株、培養(yǎng)乳酸菌株、收集菌體、冷凍干燥和真空包裝等[24]。篩選并培養(yǎng)具優(yōu)良性狀的菌種，是制備高效濃縮型凍干發(fā)酵劑的基礎(chǔ)，菌株不僅要具備發(fā)酵特性、適應(yīng)性，還應(yīng)滿足具有良好的抗冷凍干燥特性、易培養(yǎng)、生長穩(wěn)定期的活細(xì)胞量較大等生理生化指標(biāo)。在發(fā)酵過程中的對數(shù)生長期末期或穩(wěn)定生長期就可以濃縮收集細(xì)胞[25-27]，此階段菌體活性較強(qiáng)，抗逆性較好，再將菌體與適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑混合后進(jìn)行真空冷凍干燥，即可得到真空包裝的乳酸菌發(fā)酵劑[28-29]。

相比傳統(tǒng)保藏方法，真空冷凍干燥保存具有突出的優(yōu)點(diǎn)。整個(gè)真空冷凍干燥的過程處于程序控溫(-40～30℃)、高真空狀態(tài)下，乳酸菌能保持良好活性；干燥過程中，由于細(xì)菌無法生長、酶的作用難以進(jìn)行，乳酸菌能保持原來形狀；而且在真空狀態(tài)下進(jìn)行干燥，氧氣少，物質(zhì)不易氧化；此外，干制品一般可維持原有骨架結(jié)構(gòu)，保持原來形態(tài)；凍干制品是冰晶升華制成的，多孔結(jié)構(gòu)擁有理想的速溶性和迅速復(fù)水性，研究表明，采用真空或充氮的方式來包裝凍干制品，可有效保存長達(dá)數(shù)10年之久[30]。

真空冷凍干燥法也具有一定局限性，根據(jù)李寶磊[28]的研究，保存過程會(huì)對乳酸菌造成損傷，其類別如下：一、機(jī)械損傷。低溫下，細(xì)胞生成的冰晶產(chǎn)生機(jī)械力量，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)使細(xì)胞死亡。冰晶大小直接影響對細(xì)胞膜的機(jī)械損傷。目前許多學(xué)者認(rèn)為較大的降溫速率更易引起細(xì)胞內(nèi)冰晶的生成，這通常也是快速降溫階段導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要原因[31-32]。二、溶質(zhì)損傷。原因是水分凍結(jié)使細(xì)胞間隙內(nèi)液體濃縮，電解質(zhì)濃度明顯增加，這種情況下，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓使細(xì)胞脫水，胞內(nèi)蛋白對高濃度電解質(zhì)敏感，發(fā)生變性，喪失功能，細(xì)胞死亡幾率增加。一般來說，較高的間隙液體濃度易造成細(xì)胞死亡?！叭芤盒?yīng)”被認(rèn)為是慢速降溫導(dǎo)致細(xì)胞損傷的原因[31，33]。三、細(xì)胞膜損傷。細(xì)胞膜中磷脂極性端通常以水合形式存在，水分子把每個(gè)磷脂極性端與其它磷脂分子極性端間隔開。干燥脫水時(shí)，磷脂極性端的水合氫鍵消失，使?；奂錁O性端密度增加，糖鏈間范德華力變大，處于液晶態(tài)的脂膜此時(shí)將變成凝膠態(tài)，相的變化使細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部可溶性物質(zhì)的滲漏，細(xì)胞膜兩側(cè)離子失去平衡，致使細(xì)胞死亡，凍干過程中，通常細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度、鏈長度、鏈分支狀態(tài)或環(huán)繞狀態(tài)存在著動(dòng)態(tài)變化，而這些又與膜流動(dòng)性關(guān)系緊密。乳酸菌干燥時(shí)候，較大程度是由于膜脂結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，促使膜流動(dòng)性或完整性改變，從而造成膜功能失調(diào)，影響生命活動(dòng)[34-36]。四、細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)作用的損傷。如果細(xì)胞內(nèi)某關(guān)鍵酶失去活性，細(xì)胞代謝受阻，影響正常生理功能的部分產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，造成細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。凍干時(shí)候，乳酸菌胞內(nèi)的一些重要酶(如乳酸脫氫酶、ATP 酶、β-半乳糖苷酶等)由于失去水分，發(fā)生分子間氫鍵斷裂，多肽鏈展開，改變空間構(gòu)象，蛋白質(zhì)功能受損，影響凍干乳酸菌活性，為了避免這種損傷，可以加入凍干保護(hù)劑，減少代謝酶在凍干時(shí)受損程度，增加凍后生長率恢復(fù)[27，35，37]。

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(本文文獻(xiàn)格式：于金迪，楊弘華，黃若儀，等.液態(tài)條件下乳酸菌保存方法研究進(jìn)展 [J].山東化工，2016，45(08)：42-43，50.)

2016-04-07

省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201413177032)資助

于金迪(1994—)，女，河南周口人，本科學(xué)歷，主要研究生物資源開發(fā)與利用。

Q93-336

A

1008-021X(2016)08-0042-02