岳林芳，王俊國,*，薩如拉，包秋華，田文靜，陳 霞，張和平（.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008）

培養(yǎng)條件對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑抗冷凍干燥性能影響的研究進(jìn)展

岳林芳1，王俊國1,*，薩如拉2，包秋華1，田文靜1，陳 霞1，張和平1
（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌發(fā)酵劑應(yīng)具有高活力、耐貯藏性以及對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性，特別是在冷凍干燥過程中活性的保持。本文從乳酸菌發(fā)酵劑菌種的內(nèi)在特性、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度及pH值的變化等方面綜述了不同培養(yǎng)條件對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑抗冷凍干燥性能影響的研究進(jìn)展。說明乳酸菌在冷凍干燥中的存活率依賴于它的內(nèi)在基因，基因差別決定了不同的乳酸菌對(duì)冷凍干燥的抗性存在差異；同時(shí)與細(xì)胞膜成分以及菌株形態(tài)有一定的關(guān)聯(lián)；通常生長(zhǎng)在穩(wěn)定期的乳酸菌其抗冷凍干燥能力較強(qiáng)；培養(yǎng)基成分對(duì)菌株的影響因菌株不同而異；較低的培養(yǎng)溫度和pH值，有助于提高乳酸菌的抗冷凍干燥性能。本文為提高乳酸菌的凍干存活率提供一些參考。

乳酸菌發(fā)酵劑；冷凍干燥；不同培養(yǎng)條件；存活率

近些年來，伴隨著我國發(fā)酵乳制品25%以上的年增長(zhǎng)速率[1]，乳酸菌發(fā)酵劑在國內(nèi)的應(yīng)用也迅速普及開來。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新的方法被用來生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑，如真空干燥、噴霧干燥及流化床干燥等，但到目前為止冷凍干燥技術(shù)被認(rèn)為是最方便和最成功的方法[2-3]。盡管費(fèi)用較高，但它能長(zhǎng)久保持發(fā)酵劑的活力，便于貯藏和應(yīng)用[4-5]。

在冷凍干燥過程中，乳酸菌發(fā)酵劑不可避免地會(huì)受到冷凍和干燥帶來的各種損傷，導(dǎo)致菌株存活率降低、活力下降，進(jìn)而造成生產(chǎn)成本的增加，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。因此如何提高菌株在冷凍干燥過程中的存活率是制作高效濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑的核心技術(shù)之一，但由于我國在此項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)的缺失，導(dǎo)致目前國內(nèi)乳品企業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵乳制品所采用的乳酸菌發(fā)酵劑幾乎全部被國外企業(yè)所壟斷。

盡管有大量的研究證明，冷凍干燥保護(hù)劑以及冷凍干燥的工藝對(duì)乳酸菌的存活率起著非常關(guān)鍵的作用，但越來越多的研究表明，乳酸菌的生長(zhǎng)條件對(duì)其抗冷凍干燥性能也起著非常重要的作用，通過改變?nèi)樗峋纳L(zhǎng)條件可以明顯地提高乳酸菌抗冷凍干燥的性能[2-7]。

本文從菌種的內(nèi)在特性、培養(yǎng)條件等方面分析了影響乳酸菌發(fā)酵劑抗冷凍干燥的一些因素，為我國生產(chǎn)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑提供一定的理論參考。

1 乳酸菌的內(nèi)在特性

制備高效濃縮型冷凍干燥發(fā)酵劑對(duì)菌株的要求不僅體現(xiàn)在良好的發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)香以及較弱的后酸化等生產(chǎn)性能方面，同時(shí)也應(yīng)具有較強(qiáng)的抗冷凍抗干燥的性能。只有這樣才能保證冷凍干燥后的發(fā)酵劑菌株具有足夠的活菌數(shù)。與乳酸菌抗冷凍干燥特性相關(guān)的內(nèi)在因素主要有以下幾個(gè)方面。

1.1 遺傳物質(zhì)

眾所周知，微生物的冷凍干燥存活率依賴于它的內(nèi)在基因，這種基因差別決定了不同的乳酸菌對(duì)冷凍干燥的抗性存在差異，有些特定的菌株對(duì)冷凍干燥特別敏感，常常在凍干后喪失了活性。但對(duì)大多數(shù)乳酸菌而言，對(duì)冷凍干燥未顯示出特別的敏感性[2,4,7]。研究表明在冷凍干燥過程中，細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)如DNA、RNA及核糖體等將受到影響，這將導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA的復(fù)制以及蛋白質(zhì)的合成出現(xiàn)問題[4,8]。

除了遺傳物質(zhì)外，不同乳酸菌間的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及菌株形態(tài)等差異也會(huì)造成其對(duì)冷凍干燥的抗性不同[9]。

1.2 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)

細(xì)胞膜是將乳酸菌與外界環(huán)境隔離的主要屏障，因此在冷凍干燥過程中它將是首要被傷害目標(biāo)，這種傷害體現(xiàn)在膜完整性的破壞[10]。細(xì)胞膜中較高含量的不飽和脂肪酸或環(huán)丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）有助于增強(qiáng)菌株的抗冷凍能力[5,6,11-12]。不飽和脂肪酸的熔點(diǎn)較低，可以保持菌株在冷凍過程中細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而起到維持細(xì)胞膜的功能，增強(qiáng)其抗冷凍性[12]。關(guān)于環(huán)丙烷化脂肪酸的作用有所爭(zhēng)論：有些人認(rèn)為同不飽和脂肪酸的作用一樣，體現(xiàn)在增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性上，當(dāng)凍干時(shí)其能防止脂肪酸過緊地結(jié)合到細(xì)胞膜上[13-15]；也有人認(rèn)為與順式雙鍵的結(jié)構(gòu)相比，環(huán)丙烷的環(huán)狀結(jié)構(gòu)會(huì)使膜變得僵化，流動(dòng)性下降，它約束了?；湹囊苿?dòng)和失序，從而防止了在冷凍干燥過程中膜的完整性受到破壞[5,16]。因此，可通過測(cè)定菌株細(xì)胞膜中脂肪酸的組成成分及其含量判斷不同菌株的抗冷凍能力。

1.3 菌株形態(tài)

研究發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞形態(tài)、大小對(duì)冷凍干燥過程中乳酸菌的存活率有一 定的影響，如形狀呈小球型的球菌比長(zhǎng)桿狀的桿菌對(duì)冷凍干燥具有更強(qiáng)的抵抗力；短棒狀桿菌比長(zhǎng)纖細(xì)狀桿菌對(duì)冷凍干燥抵抗力強(qiáng)[17-18]。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能是乳酸菌細(xì)胞的表面積越大，在冷凍過程中，形成的冰晶對(duì)其細(xì)胞膜的機(jī)械損傷越大[19]。但對(duì)于明串珠菌與保加利亞乳桿菌來說恰恰相反，在相同的凍干條件下，明串珠菌的活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于桿菌的，這說明抗冷凍干燥性能和菌株間的形態(tài)、遺傳物質(zhì)及細(xì)胞膜組成等多種因素密切相關(guān)[19-20]。

以上研究?jī)?nèi)容表明，菌株的抗冷凍干燥性能首先取決于乳酸菌的內(nèi)在基因，在此基礎(chǔ)上與細(xì)胞膜的脂肪酸構(gòu)成以及細(xì)菌的形態(tài)有一定的關(guān)聯(lián)性。總體而言，細(xì)胞膜中高含量的不飽和脂肪酸及環(huán)丙烷化脂肪酸有助于提高菌體的抗冷凍干燥能力，形狀是小球型、短棒狀的乳酸菌抗冷凍干燥能力略強(qiáng)。

2 培養(yǎng)時(shí)間

研究表明，處在不同生長(zhǎng)期的菌株對(duì)冷凍干燥的抗性有很大的差別[21-22]。生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑最理想的培養(yǎng)時(shí)間因具體菌株而異。一般來說，乳酸菌通常生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期早期，除了考慮在此階段收獲的活菌數(shù)最多外，還有一個(gè)原因是處在這個(gè)時(shí)期的菌株在冷凍干燥過程中其存活率較高[23]。有研究表明，處在幼齡期和老齡期的菌體細(xì) 胞在冷凍干燥過程中，死亡率較高，而處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期前期的菌體細(xì)胞其存活率較高[24]。Nagawa等[25]研究發(fā) 現(xiàn)，對(duì)處于穩(wěn)定期早、末期的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行冷凍干燥，其處于穩(wěn)定早期的活菌數(shù)是處于后期的100 倍。Bisutti等[2]也得到相似的結(jié)論，造成這一現(xiàn)象的原因可能是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定前期的菌體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝最 旺盛、活力也最強(qiáng)，與其他生長(zhǎng)階段的菌體細(xì)胞相比，耐受不良環(huán)境的能力也要強(qiáng)。

進(jìn)一步的研究顯示，處在穩(wěn)定期的菌株對(duì)冷凍干燥的抗性要強(qiáng)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的[10-11,21,26]。Teixeira等[27]比較了生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的保加利亞乳桿菌對(duì)干燥的抗性，結(jié)果顯示，其干燥后的存活率分別是5.80（lg（CFU/mL））和7.45（lg（CFU/mL））；Corcoran等[28]也研究了在相同干燥條件下的不同生長(zhǎng)時(shí)期鼠李糖乳桿菌的存活率，發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定期乳酸菌的存活率為31%～50%，在對(duì)數(shù)期的為14%；Rault等[29]在實(shí)驗(yàn)中證明了保加利亞乳桿菌CFL1處在穩(wěn)定期的抗冷凍性好于其處于對(duì)數(shù)期；Ampatzoglou等[30]也發(fā)現(xiàn)在不控制酸度的情況下，生長(zhǎng)在穩(wěn)定期的鼠李糖乳桿菌GG的抗冷凍干燥性能要明顯好于對(duì)數(shù)期的；Louesdon等[31]對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌RO175的研究也揭示出在穩(wěn)定期收獲的菌株抗冷凍干燥性能要明顯好于對(duì)數(shù)期的。

產(chǎn)生這些現(xiàn)象的可能原因有：處在穩(wěn)定期的菌株因?yàn)樘荚椿蚱渌衫脿I養(yǎng)物的耗盡，從而誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，提高了其對(duì)不良環(huán)境的抗性[4,32-33]；同時(shí)在特定環(huán)境下，細(xì)胞膜脂類成分發(fā)生改變，如Velly[11]、Louesdon[31]等證實(shí)了與處在對(duì)數(shù)期的乳酸菌相比，穩(wěn)定期菌體的細(xì)胞膜成分發(fā)生了改變，環(huán)丙烷化 脂肪酸（cycC19∶0）的含量顯著增加，從而使菌株抗冷凍干燥性能增強(qiáng)。環(huán)丙烷化脂肪酸被認(rèn)為是當(dāng)乳酸菌進(jìn)入穩(wěn)定期后，以C18∶1為底物合成的，已有大量研究顯示細(xì)胞膜中的環(huán)丙烷化脂肪酸含量與其抗冷凍干燥性能呈現(xiàn)正相關(guān)[6,11-12,31,34]。Schwab等[10]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些原因，發(fā)現(xiàn)處在穩(wěn)定期的乳酸菌在應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平、膜脂類的成分以及細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)上都發(fā)生了劇烈變化，導(dǎo)致其對(duì)冷凍干燥等不利條件的抗性增加。

然而，Palmfeldt等[35]對(duì)穩(wěn)定期早、中、晚期的羅伊氏乳桿菌進(jìn)行冷凍干燥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其存活率沒有明顯的差別；同樣Louesdon等[31]對(duì)分別處在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的布氏乳桿菌R1102進(jìn)行抗冷凍干燥存活率的測(cè)定，并沒有發(fā)現(xiàn)二者存在顯著差異。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于不同 菌株間的差異造成的[31-32]。

以上綜述表明，一般情況下，處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的乳酸菌其抗冷凍干燥性能要強(qiáng)于其他生長(zhǎng)階段，同時(shí)也要考慮到菌株間的特異性。

3 培養(yǎng)基成分

人們?cè)谠缙诘难芯恐嘘P(guān)注的是保護(hù)劑和不同生長(zhǎng)階段對(duì)乳酸菌抗冷凍干燥性能的影響，但近來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在冷凍干燥過程中的存活率與其生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分也有著十分密切的聯(lián)系[6,8,36-39]。

3.1 碳源和氮源

Carvalho等[40]發(fā)現(xiàn)當(dāng)用果糖、乳糖或甘露糖替代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)，保加利亞乳桿菌具有更好地抗冷凍干燥性能，其中甘露糖的效果最好。Li Chun等[6]發(fā)現(xiàn)與不含葡萄糖的MRS生長(zhǎng)培養(yǎng)基相比，添加單糖（果糖、葡萄糖）或雙糖（乳糖、蔗糖）可以明顯提高保加利亞乳 桿菌L2的冷凍干燥生存率；Chen He等[39]發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入海藻糖可以提高保加利亞乳桿菌Lb6的冷凍存活率。所以，選擇合適的碳源可以增強(qiáng)菌株抗冷凍干燥的能力。

Shao Yuyu等[8]發(fā)現(xiàn)在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的保加利亞乳桿菌ND02，冷凍干燥后的存活率為55.3%，當(dāng)在培養(yǎng)基中額外添加4%酵母浸膏時(shí)，其冷凍干燥后的存活率下降到12%。Senz等[41]調(diào)整MRS培養(yǎng)基的配方，加入一定量的豬源蛋白胨，發(fā)現(xiàn)可以明顯改善嗜酸乳桿菌NCFM抗冷凍干燥性能；與此類似，包維臣等[42]將培養(yǎng)基的氮源由酵母浸膏改為動(dòng)物蛋白胨時(shí)，保加利亞乳桿菌ND02在真空冷凍干燥過程的存活率明顯升高；Li Chun等[6]在MRS培養(yǎng)基中額外添加氨基酸，發(fā)現(xiàn)對(duì)提高保加利亞乳桿菌L2的抗冷凍干燥能力有一定的促進(jìn)作用。

造成這些現(xiàn)象的原因是多方面的。不同種類的氮源及碳源會(huì)造成乳酸菌在形態(tài)上和生理上的差異，進(jìn)而導(dǎo)致了其對(duì)外界不良環(huán)境的抗性不同。Shao Yuyu等[8]通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在額外添加酵母浸膏的MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的保加利亞乳桿菌ND02，其細(xì)菌長(zhǎng)度是空白對(duì)照的2 倍多，菌體表面積的增加將導(dǎo)致在冷凍過程中形成的冰晶對(duì)其細(xì)胞膜的機(jī)械損傷增大，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；Senz等[41]發(fā)現(xiàn)在MR S培養(yǎng)基中加入豬源蛋白胨后，嗜酸乳桿菌NCFM形成短粗桿狀的形態(tài)，其比細(xì)長(zhǎng)桿狀的在冷凍干燥過程中穩(wěn)定性更強(qiáng)。

乳酸菌對(duì)不同種類的氮源及碳源有不同的代謝途徑，進(jìn)而產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，有些代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸菌抗冷凍干燥的能力有促進(jìn)作用[36-37]。例如腸膜明串珠菌在含有蔗糖或果糖的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生甘露醇，它可以維持菌體在低水分下的活性，并能防止細(xì)菌受到氧化 傷害[43]；同樣對(duì)于海藻糖，當(dāng)它被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可以穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)，如DNA、核糖體等，從而起到抗冷凍干燥的保護(hù)作用；但當(dāng)它被乳酸菌作為碳源代謝時(shí)，反而會(huì)使酸度增加，導(dǎo)致菌體在冷凍干燥過程中死亡率增加[4]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳酸菌在含有某些碳水化合物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，代謝產(chǎn)生的胞外多糖也起到很好的抗冷凍干燥作用[23,37]。

碳水化合物 對(duì)菌體的保護(hù)作用也有可能得益于它具有羥基基團(tuán)的空間結(jié)構(gòu)，大量的羥基可以代替水分子，通過氫鍵與蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)結(jié)合維持菌體蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，防止在冷凍干燥過程中由于脫水而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性[37,39]。

除了生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不同的碳源和氮源外，在培養(yǎng)基中的其他成分也會(huì)影響在冷凍干燥過程中乳酸菌的存活率。

3.2 相容性物質(zhì)

一些研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳酸菌在含有特定成分的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，能從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中吸收些相容性物質(zhì)，這些相容性物質(zhì)的存在不影響細(xì)胞正常的功能，并能通過調(diào)節(jié)乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的滲透壓來保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)等成分進(jìn)而增強(qiáng)菌體的抗冷凍干燥能力。乳酸菌自身不能合成這些物質(zhì)，同時(shí)它們進(jìn)入菌體是個(gè)耗能過程，需要有糖類等作為能量來源，而冷凍干燥過程時(shí)間太短，不足以使菌體積累這些物質(zhì)，所以乳酸菌只能從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中吸收這些相容性物質(zhì)或它們的前體物質(zhì)[23]。這些相容性物質(zhì)通常是一些小的有機(jī)化合物，包括一些氨基酸（谷氨酸、脯氨酸等）、季銨鹽（甜菜堿、肉毒堿等）和一些糖類（蔗糖、海藻糖等）[37,44]。Santivarangkna等[23]認(rèn)為相容性物質(zhì)的存在，加強(qiáng)了水分子與細(xì)胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)的親和性，從而維持了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、酶的活性以及細(xì)胞膜磷脂的穩(wěn)定性，進(jìn)而改善了菌株在冷凍干燥中的生存率。相容性物質(zhì)的吸收與培養(yǎng)基的滲透壓有一定的關(guān)聯(lián)，增加培養(yǎng)基的滲透壓可以促進(jìn)相容性物質(zhì)的吸收[4,37,45]。

3.3 其他成分

Wright[46]、Beal[47]等發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加一定量的Ca2＋可以增強(qiáng)嗜酸乳桿菌NCFM及保加利亞乳桿菌1234-O和F對(duì)抗冷凍干燥的能力，分析其可能的原因在于以下幾點(diǎn)：在培養(yǎng)基中加入Ca2＋可以促進(jìn)乳桿菌形成短棒狀菌，從而抑制了長(zhǎng)纖細(xì)狀菌的形成，而表面積的減少可以增強(qiáng)菌株對(duì)冷凍的抵抗力[46]；添加Ca2＋形成的鈣鹽有一定的緩沖能力，可以減少培養(yǎng)過程產(chǎn)生的乳酸對(duì)其形成的傷害[46-47]；同時(shí)Ca2＋的添加還可以提高油酸和吐溫-80的效力，從而增強(qiáng)了細(xì)胞膜在冷凍過程中的流動(dòng)性[41]。

研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中所含的吐溫-80對(duì)細(xì)菌的抗冷凍性影響也非常大。Hansen等[48]分別在MRS培養(yǎng)基中加入吐溫-80、吐溫-20、亞油酸及亞麻酸等不同脂肪酸，發(fā)現(xiàn)在含有吐溫-80培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的嗜酸乳桿菌La-5抗冷凍性最強(qiáng)；Smittle等[49]將保加利亞乳桿菌分別培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基和不含吐溫-80的 MRS培養(yǎng)基中，液氮冷凍后細(xì)胞死亡率分別為5%和100%；當(dāng)培養(yǎng)于TYLCS培養(yǎng)基時(shí)，死亡率為68%，加入吐溫-80后死亡率降至5%。在培養(yǎng)液中加入吐溫-80后可能是促進(jìn)了乳酸菌的代謝，使得細(xì)胞膜上飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變速率加快，不飽和脂肪酸的增加有助于保持膜在凍干過程中的流動(dòng)性[48,50-51]；同時(shí)添加吐溫-80也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，防止冷凍過 程中細(xì)胞內(nèi)形成冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害[48]；而Hillgren等[52]認(rèn)為在凍干過程中與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子逐漸脫落，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，而吐溫-80可以取代水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，維持其構(gòu)象和功能的穩(wěn)定性，從而提高了細(xì)菌的存活率。

3.4 培養(yǎng)基成分的缺失

研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基成分的缺失也有可能產(chǎn)生額外的效果。為了驗(yàn)證饑餓是否會(huì)對(duì)菌株的抗冷凍干燥性能產(chǎn)生影響，Carvalho等[36]將保加利亞乳桿菌懸浮在20 ℃水中處理20 min，發(fā)現(xiàn)與沒有處理過的菌體相比，其抵抗冷凍干燥的性能明顯增加；Wang等[34]將經(jīng)過饑餓誘導(dǎo)的嗜酸乳桿菌RD758與正常菌株相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)可以顯著提高其抗冷凍干燥性能。但Siaterlis等[38]卻得出相反的結(jié)論，當(dāng)將MRS生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的葡萄糖減少一半時(shí)，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌GG對(duì)冷凍干燥的抵抗力大幅度降低。

為什么相似的饑餓實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生不同的現(xiàn)象？主要原因有可能存在兩點(diǎn)：一是菌株間內(nèi)在基因差異造成的；另一個(gè)是實(shí)驗(yàn)的菌株處在不同的生長(zhǎng)期。前者是將存在穩(wěn)定期的菌株進(jìn)行饑餓刺激，而后者是還未到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 末期的菌株。不同生長(zhǎng)期決定了菌株對(duì)不利環(huán)境的抗性不同，大量研究表明只有進(jìn)入穩(wěn)定期的菌株在饑餓條件下才有可能合成大量的應(yīng)激蛋白[32,34,36,38]。

經(jīng)過一定時(shí)間饑餓處理的細(xì)胞可以誘導(dǎo)基因編碼一些轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生。由此產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白可以增強(qiáng)與水的氫鍵作用，從而提高了那些大分子周圍非凍結(jié)水的含量，避免了過量水分流失對(duì)乳酸菌造成的傷害；同時(shí)在饑餓狀態(tài)下乳酸菌代謝水平和生理狀態(tài)會(huì)做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如限制RNA合成，誘導(dǎo)特定基因表達(dá)和改變某些氨基酸的生物合成等多效性反應(yīng)，經(jīng)饑餓脅迫的乳酸菌能夠更好的抵御熱脅迫、乙醇脅迫、酸脅迫和滲透壓脅迫等[32,34]。還有一個(gè)顯著的變化是饑餓效應(yīng)引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的改變，不飽和、環(huán)狀以及分枝狀脂肪酸明顯增加，這些脂類含量的增加可以降低細(xì)胞膜脂質(zhì)的固液相轉(zhuǎn)化溫度進(jìn)而維持其在冷凍干燥狀態(tài)下的流動(dòng)性。它們和菌株的抗凍性的相關(guān)性已經(jīng)被許多研究證實(shí)[5,12,34]。

綜上所述，我們可以看到培養(yǎng)基的碳源和氮源對(duì)不同菌株的影響各不相同，選擇合適的碳源和氮源可以增強(qiáng)菌株抗冷凍干燥的能力；添加適量的Ca2＋以及吐溫-80可以增強(qiáng)菌株的抗冷凍干燥能力；同樣對(duì)處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的乳酸菌而言，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的缺失可以增強(qiáng)菌株的抗冷凍干燥能力。

4 培養(yǎng)溫度以及ppHH值

大量證據(jù)表明細(xì)胞膜的脂肪酸構(gòu)成和流動(dòng)性與生長(zhǎng)環(huán)境有著一定的關(guān)聯(lián)性[10,53-55]。在乳酸菌培養(yǎng)過程中當(dāng)發(fā)酵條件（如溫度和pH值等）發(fā)生改變時(shí)，乳酸菌會(huì)調(diào)整膜中脂類的成分來保障磷脂雙分子層膜的流動(dòng)性，以便使磷脂雙分子層膜保持在一個(gè)理想的狀態(tài)，從而維持細(xì)胞的正常功能。這種調(diào)整包括改變脂肪酸的飽和程度、碳鏈的長(zhǎng)度、分支的位置、順反異構(gòu)化以及環(huán)丙烷化等[12,31,34,47]。研究顯示，有些脂肪酸成分的增加與菌株抗冷凍干燥性能的提高呈現(xiàn)正相關(guān)性，如不飽和脂肪酸、環(huán)丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）等[5,11-12,15,31,34,47]。考慮到在冷凍干燥過程中乳酸菌暴露在極端的壓力下，菌體自身不能通過調(diào)整細(xì)胞膜的性能來阻止對(duì)膜的破壞，因此在發(fā)酵過程中通過調(diào)整發(fā)酵條 件以精確控制脂肪膜的成分來提高乳酸菌的抗冷凍性被認(rèn)為是一個(gè)非常有效的方法[12,31,55]。

4.1 培養(yǎng)溫度

Wang等[14]發(fā)現(xiàn)較低的發(fā)酵溫度使嗜酸乳桿菌RD758具有更好的抗凍性，與42 ℃的生長(zhǎng)溫度相比，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，在冷凍過程中其存活率較高；其在冷凍貯藏期間發(fā)酵溫度為30 ℃或37 ℃較42 ℃的抗凍性更強(qiáng)；通過分析脂肪酸的組成及含量發(fā)現(xiàn)低溫有助于細(xì)胞膜中形成高含量的C16∶0和cycC19∶0脂肪酸、低含量的C18∶0脂肪酸，同時(shí)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值（unsaturated fatty acids/saturated fatty acids，UFAs/SFAs）也會(huì)升高。以上研究表明，在相對(duì)低的溫度下，細(xì)胞膜中脫氫酶的活性增加，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量增加，膜的流動(dòng)性增強(qiáng)[14]。但值得注意的是，細(xì)胞膜中較高含量的不飽和脂肪酸容易造成乳酸菌在貯藏期間氧化失活，特別是當(dāng)水分含量較低時(shí)[56]。低溫培養(yǎng)提高抗凍性的另一原因是促進(jìn)某些乳酸菌菌體多糖的合成。如嗜熱鏈球菌在30 ℃比40 ℃培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的不溶性多糖高2～5 倍，這種物質(zhì)可提高冷凍干燥存活率[15]。

4.2 培養(yǎng)pH值

同樣Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌RD758生長(zhǎng)在酸性pH 4.5和pH 5.0較pH 6.0在冷凍中的抗凍性更強(qiáng)，活力下降更少；而在凍藏過程中，菌體生長(zhǎng)在pH 5.0條件下，細(xì)胞抗凍性最強(qiáng)。通過分析細(xì)胞膜脂肪酸的組成及含量發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下菌株具有較高含量的cycC19∶0脂肪酸以及不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值較高。Palmfeldt等[35]研究表明培養(yǎng)基pH值為5.0時(shí)，羅伊氏乳桿菌有較強(qiáng)的抗冷凍性，而pH值為6.0時(shí)抗冷凍性較差。Beal等[47]也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵pH值為5.5時(shí)，嗜熱鏈球菌有較好的抗冷凍性，對(duì)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例分析發(fā)現(xiàn)，較低的pH值可以引起細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸的積累。

值得注意的是并非所有的菌株都能在低酸或低溫下，其抗冷凍性得到增強(qiáng)。為了研究培養(yǎng)溫度和pH值對(duì)乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸以及抗冷凍干燥性能的影響，將穩(wěn)定期的羅伊氏乳桿菌I5007放入pH 6.7的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后，與對(duì)照組（pH 5.7）相比其冷凍存活率從12.95%提高到27.38%；同樣將菌株培養(yǎng)溫度從37 ℃提高到47 ℃，保持6 h，與對(duì)照組（37 ℃）相比其冷凍存活率提高到17.87%，分析發(fā)現(xiàn)這與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例（UFAs/SFAs）的明顯提高有關(guān)[12]。

4.3 協(xié)同作用

考慮到培養(yǎng)溫度和pH值有可能對(duì)乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成存在協(xié)同作用，Li Chun等[15]通過研究保加利亞乳桿菌L2在不同發(fā)酵pH值（5.0、5.5、6.0、6.5）和溫度（30、35、37、39 ℃）條件下對(duì)其在冷凍干燥中存活的影響。通過不同組合試驗(yàn)，最后得出：L2在30 ℃、pH 5.0的培養(yǎng)條件下其冷凍干燥存活率最大為63.2%；或在39 ℃和pH 6.0條件下，其冷凍干燥存活率可達(dá)57.6%。以上兩種培養(yǎng)條件下的L2細(xì)胞膜上的cycC19∶0含量都較高。這說明培養(yǎng)溫度和pH值共同改變脂肪酸的含量，進(jìn)而影響菌體細(xì)胞的抗冷凍性。

綜合分析，我們可知選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度和培養(yǎng)pH值，可以提高菌株抗冷凍干燥性能；對(duì)一些乳酸菌來說，在較低溫度、pH值的條件下培養(yǎng)可以提高其抗冷凍干燥能力。

5 結(jié) 語

在冷凍干燥過程中，乳酸菌的存活性受到內(nèi)在與外在多種因素的影響。從內(nèi)在因素分析，首先取決于乳酸菌的內(nèi)在基因，在此基礎(chǔ)上與細(xì)胞膜的脂肪酸構(gòu)成以及細(xì)菌的形態(tài)有一定的關(guān)聯(lián)性，總體而言，細(xì)胞膜中高含量的不飽和脂肪酸及環(huán)丙烷化脂肪酸有助于提高菌體的抗冷凍干燥能力，形狀呈小球型、短棒狀的乳酸菌抗冷凍干燥能力略強(qiáng)。

對(duì)外在的培養(yǎng)條件而言，處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的乳酸菌其抗冷凍干燥性能要強(qiáng)于其他生長(zhǎng)階段；培養(yǎng)基的碳源和氮源對(duì)不同菌株的影響各不相同，選擇合適的碳源和氮源可以增強(qiáng)菌株抗冷凍干燥的能力；添加適量的Ca2＋以及吐溫-80可以增強(qiáng)菌株的抗冷凍干燥能力；同樣對(duì)處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的乳酸菌而言，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的缺失可以增強(qiáng)菌株的抗冷凍干燥能力；選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度和培養(yǎng)pH值，可以提高菌株抗冷凍干燥性能，對(duì)一些乳酸菌來說，在較低溫度、pH值的條件下培養(yǎng)可以提高其抗冷凍干燥能力。

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Effects of Culture Conditions on the Survival of Freeze-Dried Lactic Acid Bacterial Starter Cultures

YUE Linfang1, WANG Junguo1,*, SA Rula2, BAO Qiuhua1, TIAN Wenjing1, CHEN Xia1, ZHANG Heping1
(1. Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Education of Ministry, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

High viability, storability and tolerance to variable environmental conditions, especially to freeze-drying, are key factors in the development of lactic acid bacteria (LAB) starter cultures. The effects of diverse growth conditions on the survival of LAB during subsequent freeze-drying are reviewed in this article, including intrinsic factors of strains, culture time, medium components, and changes in temperature and pH. This review illustrates that the survival of lactic acid bacteria during freeze-drying depends on its inherent genes, and genetic differences determine different resistance of lactic acid bacteria to freeze-drying. At the same time, the survival of lactic acid bacteria is associated with components of the cell membrane and the bacterial morphology. Lactic acid bacteria usually have stronger tolerance to freeze-drying when they are cultured in the stable phase. Medium components have different influences on different LAB strains. The lower culture temperature and pH helps improve the tolerance of lactic acid bacteria to freeze-d rying. This paper may provide a reference for improving the survival ability of LAB during freeze-drying.

lactic acid bacterial starter culture; freeze-drying; diverse culture conditions; survival ability

10.7506/spkx1002-6630-201611047

TS252.54

A

1002-6630（2016）11-0270-07

岳林芳, 王俊國, 薩如拉, 等. 培養(yǎng)條件對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑抗冷凍干燥性能影響的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 270-276. DOI:10.7506/spkx1002-66 30-201611047. http://www.spkx.net.cn

YUE Linfang, WANG Junguo, SA Rula, et al. Effects of culture conditions on the survival of freeze-dried lactic acid bacterial starter cultures[J]. Food Science, 2016, 37(11): 270-276. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611047. http://www.spkx.net.cn

2015-07-03

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160315）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015MS0306；2013MS1207）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301516；31301517）；內(nèi)蒙古自治區(qū)配套中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

岳林芳（1992—），女，碩士研究生，主要從事乳品微生物研究。E-mail：2897040584@qq.com

*通信作者：王俊國（1970—），男，教授，博士，主要從事乳品工藝與生物技術(shù)研究。E-mail：junguo379@aliyun.com