丁繼業(yè) 張鵬 陳琳 洪楓

201620上海，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院

新型多微孔細(xì)菌纖維素組織工程支架材料的制備及表征

丁繼業(yè) 張鵬 陳琳 洪楓

201620上海，東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院

目的當(dāng)細(xì)菌纖維素（BC）作為組織工程支架時(shí)，動(dòng)物細(xì)胞在其納米級(jí)網(wǎng)絡(luò)中無法很好延展和分化生長，因此無法獲得完美的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。為此，本研究開發(fā)出一種新型綠色環(huán)保方法制備出孔徑分布在50～800 μm的多微孔BC材料，以期今后用作組織工程支架。方法將BC水凝膠浸入過氧化氫溶液中，并加入不同質(zhì)量的亞氯酸鈉固體，氧化反應(yīng)瞬間發(fā)生，產(chǎn)生的大量氣體在BC水凝膠內(nèi)部形成了50～800 μm的氣孔。結(jié)果氣孔直徑分布可隨過氧化氫-亞氯酸鈉的體積質(zhì)量比不同而變化。紅外光譜分析表明反應(yīng)過程中無纖維素被氧化。多微孔BC水凝膠的含水率與原BC水凝膠相似，但其楊氏模量為26.1 kPa，低于致孔前的69.9 kPa。噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明多微孔BC水凝膠材料更適宜細(xì)胞成長，具有成為骨組織工程支架的潛力。結(jié)論該制備方法不僅簡(jiǎn)單易行，實(shí)驗(yàn)原料安全性好，而且有較廣闊的應(yīng)用前景，可推廣用于其他凝膠材料致孔，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

細(xì)菌纖維素；微孔；組織工程支架；表征

Fund program：National Natural Science Foundation of China(51373031);Program for New Century Excellent Talents in University(NCET-12-0828);Science and Technology Commission of Shanghai Municipality(15520720800); Fundamental Research Funds for the Central Universities

0 引言

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose,BC）是一種由木醋桿菌等細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)出來的天然纖維素。自1886年Brown首次報(bào)道BC以來，世界各國開展了大量的相關(guān)研究。作為一種新型生物材料，BC水凝膠擁有眾多特性，譬如極強(qiáng)的持水性、高聚合度和結(jié)晶度、高的濕強(qiáng)度以及良好的生物相容性和無過敏反應(yīng)性等[1-2]，在創(chuàng)傷敷料[3]、人工血管[4]、組織工程支架[5-7]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。

細(xì)胞支架材料是組織工程領(lǐng)域的重要組成部分，作為優(yōu)良的細(xì)胞支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①生物相容性好、無毒、無免疫原性。②可降解，有一定的孔隙率和力學(xué)強(qiáng)度。③支架能維持細(xì)胞形態(tài)和表型，并促進(jìn)細(xì)胞黏附與增殖，誘導(dǎo)組織再生。④相互連通的三維、多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[9]。因此，尋找理想的支架材料是組織工程研究的熱點(diǎn)之一。目前，人們已利用纖維黏結(jié)、溶液澆注、顆粒瀝析、氣體發(fā)泡、相分離技術(shù)、冷凍干燥和快速成型等技術(shù)制備出膠原、殼聚糖[10]、甲殼素、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等眾多的高分子組織工程支架[11]。與上述材料相比，BC水凝膠因其優(yōu)良的特性可作為優(yōu)秀組織工程支架，已在軟骨、神經(jīng)導(dǎo)管及人工血管等替代材料方面研究多年。目前，國內(nèi)外多微孔BC水凝膠支架材料的制備主要分為以下4種方法：①在發(fā)酵培養(yǎng)液中加入石蠟[5,12-13]、淀粉[14]等顆粒狀物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，除去致孔物質(zhì)，得到帶有孔狀結(jié)構(gòu)的BC水凝膠。②改變發(fā)酵條件，并在發(fā)酵過程中加入微球，培養(yǎng)出多微孔BC水凝膠[15]。這兩種方法雖可制備出微孔材料，但其反應(yīng)時(shí)間較長，實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜。③對(duì)培養(yǎng)獲得的BC水凝膠進(jìn)行致孔改性，得到多微孔材料。該法較為普遍，且方法較多，包括加入致孔劑如冰晶[16]、氯化鈉晶體[17]，發(fā)泡劑如偶氮二甲酰胺[18]等。該法雖簡(jiǎn)單易行，但所用致孔劑或發(fā)泡劑均為有毒或價(jià)格昂貴的藥品。④另一種較為常用的方法是將BC水凝膠絞碎后，加入瓊脂糖攪拌凍干，制備出多微孔材料[19]。由于BC水凝膠被絞碎后，將失去自身優(yōu)異的機(jī)械性能，故很難廣泛應(yīng)用于骨組織工程支架材料上。

為克服傳統(tǒng)方法制備多微孔BC水凝膠造成的缺陷，本研究通過亞氯酸鈉與過氧化氫反應(yīng)，利用劇烈反應(yīng)瞬間釋放的氣體沖入BC水凝膠內(nèi)部，形成50～800 μm的氣孔，來制備多微孔BC水凝膠；再通過使用各種測(cè)試分析手段對(duì)獲得的多微孔BC水凝膠進(jìn)行初步性能評(píng)價(jià)，為今后的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

葡萄糖、胰蛋白胨、瓊脂粉、二甲基亞砜、過氧化氫（質(zhì)量濃度為0.3 g/ml，分析純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），亞氯酸鈉（80%）（英國AlfaAesar公司），木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus ATCC23770）（美國ATCC），酵母浸粉（英國Oxoid公司），小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司），雙抗（上海捷瑞生物工程有限公司），PBS（美國Sigma公司）。

MULTISKAN酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），BM-37XB倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠），BX53正置顯微鏡（日本Olympus公司），BB15二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），傅里葉變換紅外拉曼光譜儀（FTIR-Raman）（美國Nicolet公司），H5K-S萬能材料測(cè)試機(jī)（英國Hounsfield公司），JSM-5600LV掃描電鏡（日本JEOL公司），LYOQUEST-55 PLUS冷凍干燥機(jī)（西班牙Telstar公司），SW-CJ雙人單面潔凈工作臺(tái)（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BC的制備及預(yù)處理

將菌種接到無菌液體培養(yǎng)基（葡萄糖25 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，pH值用檸檬酸調(diào)至5.0）后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10～13 d。將培養(yǎng)得到的BC水凝膠置于濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉水溶液中，在80℃條件下處理2 h，連續(xù)處理3次以上。最后，用去離子水沖洗干凈至pH值為中性，得乳白色半透明膜狀BC水凝膠。

1.2.2 多微孔BC水凝膠的制備及工藝優(yōu)化

將BC水凝膠切成直徑為50mm的圓片，浸漬于5ml質(zhì)量濃度為0.3 g/ml的過氧化氫溶液中24 h后，立即加入質(zhì)量濃度為1g/ml的亞氯酸鈉水溶液5 ml，并轉(zhuǎn)移至80℃水浴鍋中加熱并攪拌，使反應(yīng)均勻。反應(yīng)瞬間BC水凝膠內(nèi)部釋放出大量大小不一的氣泡，形成大量氣孔。反應(yīng)結(jié)束后，使用去離子水將多微孔BC水凝膠進(jìn)行反復(fù)浸泡并清洗至中性。

為研究反應(yīng)劇烈程度對(duì)形成氣孔孔徑的影響，分別加入體積-質(zhì)量比為5 ml∶2.5 g、5 ml∶5 g、5 ml∶7.5 g及5 ml∶10 g的過氧化氫與亞氯酸鈉。

1.2.3 多微孔BC水凝膠的表征

（一）微孔孔徑測(cè)定

反應(yīng)結(jié)束后將水凝膠樣品置于載玻片上，使用OLYMPUS顯微成像系統(tǒng)放大40倍，對(duì)多微孔水凝膠樣品中的孔徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將氣孔孔徑分為50～250 μm、250～500 μm和＞500 μm 3個(gè)部分，通過在每個(gè)樣品圖中隨機(jī)選取100個(gè)氣孔，以cellSensStandard軟件測(cè)量其孔徑，可得到不同反應(yīng)條件下生成的多微孔BC水凝膠中不同孔徑所占比例。

（二）紅外光譜分析

為了檢測(cè)多微孔BC水凝膠內(nèi)部是否發(fā)生氧化，將致孔前后的BC水凝膠置于60℃下干燥24 h，然后分別采用傅里葉變換紅外拉曼光譜儀測(cè)試，得到BC水凝膠和多微孔BC水凝膠在4 000～600 cm-1范圍內(nèi)的吸收曲線。

（三）含水率測(cè)定

分別使用濾紙去除BC水凝膠和多微孔BC水凝膠表面的水分并稱質(zhì)量，然后在105℃下烘48 h。烘干結(jié)束后，將所有膜稱質(zhì)量。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。含水率用如下公式計(jì)算

式中：Wi為水凝膠的濕質(zhì)量，Ws為水凝膠烘干后的干質(zhì)量。

（四）掃描電鏡觀察

將BC水凝膠和多微孔BC水凝膠使用液氮冷凍脆斷，并于冷凍干燥機(jī)中凍干，噴金鍍膜后利用掃描電鏡觀察其斷面。

（五）機(jī)械性能測(cè)試

將BC水凝膠裁剪成10 cm×1 cm的條狀樣品，然后使用萬能材料測(cè)試機(jī)夾住材料兩端，沿著中心軸兩端的方向進(jìn)行拉力測(cè)試。夾具之間的距離為3 cm，移動(dòng)速率為100 mm/min，記錄每個(gè)樣本的絕對(duì)拉力和應(yīng)變力曲線。每個(gè)樣品至少做10個(gè)平行測(cè)試，最后取平均值。

（六）細(xì)胞相容性測(cè)試

噻唑藍(lán)（MTT）比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在一定波長處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

在組織工程領(lǐng)域，對(duì)材料的要求是細(xì)胞必須能依附材料生長，故測(cè)試細(xì)胞在材料上的生長情況是極其重要的一步。將BC水凝膠和多微孔BC水凝膠切割成圓片狀，大小與24孔板內(nèi)小孔一致，小心地將原BC水凝膠和多微孔BC水凝膠的上表層撕下，于121℃下滅菌20 min，冷至室溫后，置于24孔板內(nèi)，并放上鋼環(huán)用于壓住材料。每孔加入400 μl無菌PBS，浸漬2 h后吸出并換新的無菌PBS，重復(fù)6次以上，吸出廢液；加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液，浸漬24 h以使細(xì)胞更易黏附，將廢液吸出；將培養(yǎng)瓶里的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1使用無菌PBS沖洗兩次，再用胰蛋白酶/EDTA消化1 min后計(jì)數(shù)，將一定量的細(xì)胞接種于兩種材料的無上表皮一面，并補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基，使所有孔中的液體體積均為400 μl；將接種后的孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%的條件下培養(yǎng)；分別將培養(yǎng)1、3、5、7 d后的培養(yǎng)板取出，吸出培養(yǎng)液，并用無菌PBS小心沖洗一遍后吸出廢液，每孔加入20 μl MTT溶液（質(zhì)量濃度為5 mg/ml），在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩30 min，使結(jié)晶紫充分溶解，最后在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。由于細(xì)胞濃度與吸光度值成正比，故由吸光度值大小可間接反映出細(xì)胞的生長情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用多因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 微孔孔徑測(cè)定

圖1顯示的是隨著過氧化氫與亞氯酸鈉體積質(zhì)量比的變化，制成的多微孔BC水凝膠在光學(xué)顯微鏡下孔徑大小的分布情況。通過光學(xué)顯微鏡圖與統(tǒng)計(jì)柱形圖可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體積質(zhì)量比逐漸變大時(shí)，多微孔BC水凝膠中氣孔的平均孔徑逐漸變小。這可能是由于隨著體積質(zhì)量比變大，反應(yīng)劇烈程度逐漸變強(qiáng)，隨之產(chǎn)生更多的小氣泡瞬間擠進(jìn)纖維素的空隙中，形成更多小氣孔。

2.2 紅外光譜分析

由圖2可知，多微孔BC水凝膠并未產(chǎn)生特異的吸收峰，實(shí)際上，多微孔BC水凝膠的光譜與致孔前BC水凝膠的譜圖非常相似，各特征基團(tuán)并未發(fā)生氧化而產(chǎn)生新的吸收峰。由于本研究所用的反應(yīng)藥品均易溶于水，使用去離子水沖洗即可輕易除去，故經(jīng)過多次清洗，可認(rèn)為過氧化氫與亞氯酸鈉均已被去除。

2.3 含水率測(cè)定

圖1 過氧化氫與亞氯酸鈉的體積質(zhì)量比對(duì)多微孔細(xì)菌纖維素水凝膠孔徑分布的影響

由測(cè)試結(jié)果可知，致孔前BC水凝膠的含水率為（99.69±0.02）%；而致孔后的多微孔BC水凝膠的含水率并未發(fā)生變化，依然維持在99%以上，平均值為（99.65±0.04）%，與致孔前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明本研究采用的制備多微孔BC水凝膠材料的方法并不影響原材料的含水率大小。

圖2 細(xì)菌纖維素水凝膠與多微孔細(xì)菌纖維素水凝膠的紅外光譜圖

2.4 掃描電鏡觀察

由圖3可以看出，BC水凝膠致孔前具有十分致密的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3A），其孔徑過小使得細(xì)胞無法滲透入三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，從而使得細(xì)胞無法在其內(nèi)部生長分化；而在致孔后的多微孔BC水凝膠斷面，可清晰觀察到孔徑在50～800 μm的小孔，適合細(xì)胞進(jìn)入生長分化（圖3B）。圖3還表明多微孔BC水凝膠內(nèi)部小孔的形狀是不規(guī)則的，這可能是由于致孔時(shí)，氧化劑產(chǎn)生的氣泡在BC水凝膠內(nèi)擠壓而成無規(guī)則狀，最終導(dǎo)致材料凍干后形狀也是無規(guī)則的。

圖3 細(xì)菌纖維素水凝膠和多微孔細(xì)菌纖維素水凝膠的掃描電鏡圖

2.5 拉力測(cè)試

拉力測(cè)試結(jié)果表明，BC水凝膠致孔前的平均應(yīng)力和應(yīng)變分別為（13.0±4.3）kPa和（28.1±7.4）%，而致孔后的多微孔BC水凝膠的平均應(yīng)力和應(yīng)變分別為（7.0±1.2）kPa和（26.7±1.6）%，均有明顯降低（P＜0.05）；且致孔前BC水凝膠的楊氏模量為（69.9±1.4）kPa，而致孔后的多微孔BC水凝膠的楊氏模量僅有（36.1±1.3）kPa。雖然楊氏模量有明顯的降低（P＜0.05），但依據(jù)已有研究結(jié)果，此多微孔BC水凝膠材料依然適用于作為非承重部位的骨組織替代材料，如面部或顱骨部位骨板等[20]。

2.6 細(xì)胞相容性測(cè)試

小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1在不同材料上的生長情況如圖4所示：致孔前BC水凝膠上的細(xì)胞生長緩慢，這主要是由于材料過于致密的纖維網(wǎng)絡(luò)，使得細(xì)胞無法生長分化；而多微孔BC水凝膠在第3天即可明顯看到細(xì)胞快速生長增殖，細(xì)胞相容性較好，與BC水凝膠比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在第7天，兩者差異更為明顯（P＜0.01）。這主要是由于多微孔BC水凝膠在撕下表層光滑膜后，露出內(nèi)部的多孔粗糙結(jié)構(gòu)更易使細(xì)胞附著，并提供了可供細(xì)胞在內(nèi)部生長增殖的空間，故細(xì)胞可輕易附著并快速生長分化。

3 結(jié)論

利用過氧化氫與亞氯酸鈉劇烈反應(yīng)瞬間釋放大量氣泡，可制備孔徑在50～800 μm的多微孔BC水凝膠材料，反應(yīng)過程中纖維素未被氧化。多微孔BC水凝膠的含水率高達(dá)99%以上，與致孔前BC水凝膠無明顯差異。通過控制反應(yīng)體系中過氧化氫與亞氯酸鈉的體積質(zhì)量比，可調(diào)節(jié)多微孔BC水凝膠內(nèi)部氣孔的大小。多微孔BC水凝膠的應(yīng)變應(yīng)力及楊氏模量相對(duì)于致孔前BC水凝膠均有所減小。致孔后的多微孔BC水凝膠材料更適宜細(xì)胞成長，具有成為骨組織工程支架的潛力。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)多微孔BC水凝膠材料的研究僅停留在理化性質(zhì)研究的初級(jí)水平，若想將其真正應(yīng)用于醫(yī)用材料領(lǐng)域，后續(xù)仍需優(yōu)化其反應(yīng)條件，開展動(dòng)物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)等研究。

圖4 BC水凝膠與多微孔BC水凝膠的細(xì)胞相容性結(jié)果

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Preparation and characterization of a new microporous bacterial cellulose material as a potential scaffold

Ding Jiye,Zhang Peng,Chen Lin,Hong Feng
College of Chemistry,Chemical Engineering and Biotechnology,Donghua University,Shanghai 201620,China Corresponding author:Hong Feng,Email:fhong@dhu.edu.cn

ObjectiveWhen bacterial cellulose(BC)is used as a scaffold material in tissue engineering,the nano-structure of BC may not provide enough space for animal cell growth and differentiation which would not achieve a perfect application in tissue engineering.In order to solve this problem,a novel"green"approach is developed in this research to produce bacterial nanocellulose materials with micropores ranging 50-800 μm.MethodsSeveral ratios of hydrogen peroxide to sodium chlorite were used to react instantly to produce a large number of bubbles in BC hydrogels,which formed micropores with diameters ranging 50-800 μm.Optical microscopy and scanning electron microscope were used to evaluate microporous BC hydrogels and verify the existence of micropores.ResultsThe size of pores could be regulated along with the changes in the amount of reactants used in the experiment.Fourier transform infrared spectroscopy verified that no cellulose was oxidized.Water content of the microporous BC hydrogels was similar to that of the original BC hydrogels.The Young's modulus of microporous BC hydrogels was 26.1 kPa,which was lower than that of the original BC hydrogels(69.9 kPa).Thiazoyl blue tetrazolium bromide(MTT) test displayed a higher viability on the microporous BC hydrogels compared to the growth on the unmodified BC substrates.ConclusionsThis study provides a convenient and promising way to prepare microporous materials, which may not be limited to only BC material,but could be used in other hydrogels.The proposed approach is suitable for extensive industrialization.

Bacterial cellulose;Micropore;Tissue engineering scaffold;Characterization

洪楓，Email：fhong@dhu.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．01．003

國家自然科學(xué)基金（51373031）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-12-0828）；上海市科委項(xiàng)目（15520720800）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目

2015-11-20）