胡華剛，陶 黎，吳佳瑩，趙宏艷，汪文來，于 崢，劉 紅，潘靜華，李 艷，王少君，張治國(guó)，劉梅潔，鞠大宏1，

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

“髓減致痿”病機(jī)的實(shí)驗(yàn)研究*

胡華剛1，2，陶 黎2，吳佳瑩2，趙宏艷3，汪文來2，于 崢2，劉 紅3，潘靜華3，李 艷3，王少君3，張治國(guó)2，劉梅潔3Δ，鞠大宏1，3Δ

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

目的:通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討中醫(yī)“髓減致痿”病機(jī)的科學(xué)性。方法:將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎組5組，切除大鼠雙側(cè)卵巢制作骨質(zhì)疏松癥模型。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予戊酸雌二醇，補(bǔ)腎組灌胃給予左歸丸，連續(xù)給藥3個(gè)月。采用Micro CT檢測(cè)股骨BV/TV(%)，骨計(jì)量學(xué)方法檢測(cè)脛骨骨組織形態(tài)。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨丟失率顯著增加，股骨BV/TV以及脛骨TBV%均顯著減少，而TRS%、TFS%及其TRS/TFS顯著增加;同時(shí)髓腔中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞，ABS%顯著增加，而其他骨髓細(xì)胞相對(duì)減少。而給予左歸丸和戊酸雌二醇后，上述指標(biāo)在一定程度上發(fā)生逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:切除大鼠卵巢3個(gè)月后，在骨量顯著丟失的同時(shí)，骨髓中脂肪細(xì)胞大量增多而其他骨髓細(xì)胞明顯減少，而補(bǔ)腎能在一定程度上抑制這一情況的發(fā)生，證明了中醫(yī)“髓減致痿”病機(jī)的科學(xué)性。

髓減致痿;骨痿;骨質(zhì)疏松癥;脂肪細(xì)胞

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精主骨生髓，精足則髓足，骨骼得養(yǎng)則強(qiáng)健有力;精虧則髓減，骨失其養(yǎng)則脆弱易折，就會(huì)發(fā)生“骨痿”，即骨質(zhì)疏松癥。本研究擬采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度探討中醫(yī)“髓減致痿”理論的科學(xué)性，并為中醫(yī)“腎主骨”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±10)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào) SCXK-(軍) 2007-004)，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào) SYXK (京)2010-0032)。

1.1.2 藥物 左歸丸藥液組成:熟地24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，莬絲子12 g，枸杞子12 g，川牛膝9 g，龜板膠12 g，鹿角膠12 g。常規(guī)水煎減壓濃縮，制備成濃度為0.968 g生藥/ml的藥液。戊酸雌二醇:拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品(批號(hào)234A，1 mg/片)。臨用時(shí)，將戊酸雌二醇碾碎后，用純凈水制成濃度為0.0092 mg/ml的混懸液。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑:甲基丙烯酸甲酯為天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品(批號(hào)20130407);甲基丙烯酸丁酯為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品(批號(hào)20120411);苯甲酸甲酯為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品(批號(hào)20100115);聚乙二醇400為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品(批號(hào)20120714);過氧化苯甲酰為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品(批號(hào)T20090409);N，N-二甲基對(duì)甲苯胺為ALDRICH公司產(chǎn)品(批號(hào)04327MB-235)。

主要儀器:Skyscan1174 Micro-CT(比利時(shí)，Bruker公司);Reicheit-Jung2040切片機(jī)(德國(guó)，Leica公司);DM 6000B正置顯微鏡(德國(guó)，Leica公司); Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)，Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將60只SD雌性大鼠以體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只，造模組36只。造模組大鼠按照文獻(xiàn)［1］方法切除大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅摘除卵巢附近的部分脂肪組織但不摘除卵巢。術(shù)后10 d，再將造模組36只大鼠以體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)腎組各12只。然后開始灌胃給藥，補(bǔ)腎組灌胃給予0.968 g生藥/ml的左歸丸藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為9.68 g生藥/kg體質(zhì)量;陽(yáng)性對(duì)照組給予0.0092 mg/ml的戊酸雌二醇混懸液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為0.092 mg/kg。每天灌胃1次，連續(xù)6 d，休息1 d再給藥6 d，如此連續(xù)給藥3個(gè)月。每周稱重1次，據(jù)此調(diào)整給藥量?？瞻讓?duì)照組、假手術(shù)組和模型組按上法給予等體積的純凈水。

末次給藥后，將各組大鼠用戊巴比妥鈉(45 mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，然后迅速處死。取右側(cè)脛骨及股骨4%多聚甲醛固定，分別用于不脫鈣骨切片制作和Micro CT檢測(cè)。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)方法 (1)Micro CT檢測(cè)。采用Micro-CT對(duì)各組大鼠的股骨進(jìn)行掃描。將大鼠右側(cè)股骨從固定液中取出后置于生理鹽水中浸泡，為防止掃描過程中樣本出現(xiàn)脫水和移位，掃描時(shí)將股骨用浸有生理鹽水的濕紙巾包繞后放到樣本管中，固定在Micro CT載物臺(tái)上。電壓50 kV，電流800 μA，以180°掃描角度、12 μm掃描分辨率、1304× 1024視野大小沿股骨長(zhǎng)軸方向?qū)晒沁h(yuǎn)端進(jìn)行掃描。將生長(zhǎng)板下1mm定為掃描參考線，掃描參考線以下1.5 mm的區(qū)域設(shè)定為三維重建興趣區(qū)域(range of interests ROI)，用N-Recon軟件進(jìn)行骨小梁三維圖像重建，用CT-AN軟件進(jìn)行三維分析，獲得骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV(%)，即所選區(qū)域內(nèi)骨小梁總體積與樣本總體積之比;(2)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。取右側(cè)脛骨近端1/3去除軟組織，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，塑料包埋。在 Reicheit-Jung 2040切片機(jī)上，用鎢鋼刀分別切出5 μm的縱向不脫鈣骨切片，甲苯胺藍(lán)染色。

參照文獻(xiàn)［2］所述方法，采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，對(duì)不脫鈣骨切片的以下指標(biāo)進(jìn)行計(jì)量:①骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測(cè)骨髓腔總體積的百分比是衡量骨量水平的主要標(biāo)志;②骨小梁吸收表面百分比(TRS%):凹凸不平、不規(guī)則的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比:③骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比。骨丟失率(%)=(每只大鼠的TBV%值－空白對(duì)照組大鼠TBV%平均值)/空白對(duì)照組大鼠TBV%平均值× 100%。骨丟失率為正值時(shí)表示骨量增加，絕對(duì)值越大表示骨量增加越多;為負(fù)值時(shí)，表示骨量丟失，絕對(duì)值越大表示骨量丟失越多［3］。骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞體積百分比(ABS%):骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的面積占被測(cè)骨髓腔面積的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，正態(tài)分布采用單因素方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis 1-way ANOVA(k samples)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨BV/TV的變化

表1圖1比較，與假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠股骨的BV/TV顯著減少;與模型組比較，補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠股骨的BV/TV值顯著增加。

表1 各組大鼠股骨BV/TV變化比較［例(%)］

2.2 各組大鼠脛骨TBV%及骨丟失率的變化

表2顯示，模型組、補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨的TBV%顯著低于假手術(shù)組;而補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組的TBV%顯著高于模型組。與假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脛骨的骨丟失率(絕對(duì)值)顯著增加;而與模型組比較，補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組的骨丟失率(絕對(duì)值)顯著減少。

圖1 各組大鼠股骨骨小梁三維重建圖注:a-e分別代表空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)腎組的骨小梁三維重建圖

表2 各組大鼠脛骨TBV%及骨丟失率的變化

2.3 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%及TRS/TFS的變化

模型組、補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組與假手術(shù)組比較，大鼠脛骨TRS%、TFS%和TRS/TFS均顯著增加;而與模型組比較，補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組的3個(gè)指標(biāo)均顯著減少。

表3 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%及TRS/TFS的變化

2.4 各組大鼠骨髓腔中脂肪細(xì)胞變化

2.4.1 光鏡下觀察 圖2顯示，模型組大鼠脛骨骨小梁較空白對(duì)照組和假手術(shù)組顯著減少，其排列稀疏，間距加寬，小梁之間連接差。髓腔中的脂肪細(xì)胞呈圓形或類圓形的空泡狀，模型組中的脂肪細(xì)胞較空白對(duì)照組和假手術(shù)組顯著增多，而其他骨髓細(xì)胞相對(duì)減少。補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組的骨小梁較模型組明顯增多，而脂肪細(xì)胞明顯減少，其他骨髓細(xì)胞相對(duì)增多。

2.4.2 各組大鼠脛骨骨髓腔中ABS%的變化

表4顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)腎組大鼠脛骨骨髓腔中ABS%顯著增加;與模型組比較，補(bǔ)腎組和陽(yáng)性對(duì)照組ABS%顯著減少。

表4 各組大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)ABS%的變化

與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組的上述指標(biāo)均未發(fā)生明顯改變，從而排除了手術(shù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”范疇［4］。“骨痿”之名首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《素問·痿論》云:“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”;“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿。”明確指出“髓減”“髓虛”是導(dǎo)致“骨痿”的重要原因。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精主骨生髓。如《素問·六節(jié)臟象論》:“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也……其充在骨”;《素問·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》:“腎生骨髓”;《素問·痿論》:“腎主身之骨髓”，都將腎-精-髓-骨的生理功能緊密結(jié)合在一起。正如《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義》所言:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強(qiáng)?！庇纱丝梢?，腎實(shí)精足則骨髓生化有源，骨髓充足骨得以充分滋養(yǎng)而堅(jiān)固有力;若腎虛精少、骨髓化生乏源、骨髓減少、骨乏其養(yǎng)就會(huì)導(dǎo)致骨痿［5］。綜上所述，“髓減”是“骨痿”發(fā)生的基本病機(jī)，所以歷代醫(yī)家治療骨質(zhì)疏松癥多從補(bǔ)腎入手，將“補(bǔ)腎益精生髓”作為治療該病的基本大法。

本研究結(jié)果顯示，大鼠切除卵巢后骨丟失顯著增加，BV/TV以及TBV%顯著減少;而代表骨吸收指標(biāo)的TRS%和TRS/TFS以及代表骨形成指標(biāo)的TFS%均顯著增高，說明卵巢切除所造成的是一種骨吸收和骨形成均增高，但由于骨吸收大于骨形成，進(jìn)而導(dǎo)致骨量丟失的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。病理觀察顯示，模型組大鼠脛骨骨小梁較假手術(shù)組顯著減少，其排列稀疏、間距加寬發(fā)生“骨痿”。同時(shí)，髓腔中的脂肪細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增多，而其他骨髓細(xì)胞相對(duì)減少。形態(tài)計(jì)量結(jié)果進(jìn)一步顯示，模型組TBV%顯著減少的同時(shí)，其ABS%顯著增高。脂肪細(xì)胞的顯著增多，導(dǎo)致其他骨髓細(xì)胞明顯減少，即出現(xiàn)了“髓減”。這一結(jié)果說明，“髓減”與“骨痿”之間存在著密切聯(lián)系。而采用左歸丸補(bǔ)腎后，在骨小梁明顯增多的同時(shí)，髓腔中ABS%明顯下降，即髓腔中的脂肪細(xì)胞明顯減少，而骨髓細(xì)胞明顯增多，從而進(jìn)一步證明中醫(yī)“髓減致痿”病機(jī)的正確性，同時(shí)也說明“腎主骨”理論的科學(xué)性。

現(xiàn)代研究表明，大鼠脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有多向分化潛能，在體外經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后顯示出較強(qiáng)的成骨分化能力。雌二醇可促進(jìn)ADSCs的增殖，并能提高其向成骨細(xì)胞分化的能力［6-8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去卵巢大鼠補(bǔ)充雌二醇后骨髓中的脂肪細(xì)胞明顯減少，而其他骨髓細(xì)胞明顯增多，從而說明雌激素在誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞向其他骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，給予去卵巢大鼠左歸丸后也產(chǎn)生了同樣的結(jié)果。據(jù)此推測(cè)，補(bǔ)腎可能有促進(jìn)脂肪基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力，進(jìn)而使脂肪細(xì)胞明顯減少，而使其他骨髓細(xì)胞相應(yīng)增加，即通過“增髓”而達(dá)到治療“骨痿”的作用，對(duì)此還有待進(jìn)一步的深入研究。

［1］鞠大宏，張麗坤，趙紅艷，等.滋陰補(bǔ)腎法對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞IL-1和成骨細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(7):495-498.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運(yùn)動(dòng)對(duì)雌性大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.

［3］ 付小衛(wèi)，宋長(zhǎng)恒，張治國(guó)，等.從OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路探討“腎主骨”的性別差異及其機(jī)制［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2016，22(1):66-72.

［4］辛小玲，李兆弟，于崢，等.骨痿的病因病機(jī)［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(5):470.

［5］趙紅霞，于智敏，鞠大宏，等.骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證候病機(jī)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008，14(10):723-724.

［6］陳昕，丁寅，蔡川，等.雌激素對(duì)老年大鼠脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨能力的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，26(3): 340-342.

［7］MURUGANANDAN S，SINAL CJ.The impact of bone marrow adipocytes on Osteoblast and Osteoclast Differentiation［J］.IUBMB Life，2014，66(3):147-155.

［8］ MURUGANADAN S，ROMANAA，SINALCJ.Roleof chemerin/CMKLR1 signaling in adipogenesis and osteoblastogenesis of bone marrow stem cells［J］.J Bone Miner Res，2010，25(2):222-234.

Experimental Research of Etiology of“Decrease of Marrow Leading to Bone Debility”

HU Hua-gang1，2，TAO Li2，WU Jia-ying2，ZHAO Hong-yan3，WANG Wen-lai2，YU Zheng2，LIU Hong3，PAN Jing-hua3，LI Yan3，WANG Shao-jun3，ZHANG Zhi-guo2，LIU Mei-jie3Δ，JU Da-hong1，3Δ

(1.Postdoctoral Research Station，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2.Institute of Basic Theory for Chinese medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3.Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:Exploring the scientific nature of Traditional Chinese Medicine etiology of“decrease of marrow leading to bone debility”by animal experiments.Methods:SD female rats were randomly divided into blank control group，sham operation group and ovariectomized model group according to their body weights.After the operation，the model group were randomly divided into OVX group，aquadiol group and Zuogui pill group.For three consecutive months administration，rats were sacrificed and then the tibia and femur were fixed with paraformaldehyde.Longitudinal undecalcified bone sections and toluidine blue staining would be made，and bone tissue morphology and adipocyte volume percentage(ABS%)would be measured.The BV/TV(%)of femur was measured by Micro CT.Results:Compared with the sham operation group，TBV%and BV/TV of ovariectomized model group were significantly decreased，while its values of ABS%，TRS%，TFS%and TRS/TFS were evidently increased.At the same time，a large number of adipocytes appeared in the bone marrow cavity of OVX group rats，but other marrow cells were relatively reduced.After administration of Zuogui pill or estradiol valerate，the above indexes have been reversed in a certain extent.Conclusion:After three months of ovarian resection in rats，bone mass and other marrow cells of OVX group rats shin were reduced significantly while a large number of adipocytes increased in bone marrow.However，Tonifying Kidney could inhibit the occurrence of above situation in a certain extent.This experiment proved the Traditional Chinese Medicine etiology of“decrease of marrow leading to bone debility”was scientific.

Decrease of marrow leading to bone debility;Bone debility;Osteoporosis;Adipocytes

R228

B

1006-3250(2016)11-1469-03

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473551)－“髓減致痿”病機(jī)的實(shí)驗(yàn)研究

胡華剛(1983-)，男，山東濟(jì)寧人，博士后，從事傳統(tǒng)醫(yī)藥治療痹癥的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:鞠大宏(1963-)，男，遼寧鳳城人，研究員，醫(yī)學(xué)博士，博士后合作導(dǎo)師，從事中醫(yī)防治痹癥(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥)的臨床與基礎(chǔ)研究，Tel:010-64089025，E-mail: judahong@sohu.com;劉梅潔(1981-)，女(回族)，河南南陽(yáng)人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究，Tel:010-64089023，E-mail:liumeijie811@163.com。