李 勇，闕任燁，沈艷婷，林柳兵，陶智會(huì)，錢春美

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海 200071; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海 200071)

基于線粒體凋亡途徑探討納達(dá)合劑的胃黏膜保護(hù)作用機(jī)制*

李 勇1，闕任燁1，沈艷婷1，林柳兵1，陶智會(huì)1，錢春美2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海 200071; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海 200071)

目的:本實(shí)驗(yàn)旨在觀察納達(dá)合劑對(duì)膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法:利用大鼠膽汁反流性胃炎模型，將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、納達(dá)低、中、高劑量組和麥滋林組各10只。通過HE染色觀察大鼠胃黏膜病理變化，JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位變化，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胃黏膜ATP含量變化，Tunel法檢測(cè)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況，Western blotting方法檢測(cè)胃黏膜Bax、p-Bcl-2、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-9、cleaved-caspase-9片段的表達(dá)。結(jié)果:納達(dá)合劑可顯著保護(hù)大鼠胃黏膜受損，并能顯著提高胃黏膜ATP含量，雖能使線粒體膜電位水平有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納達(dá)合劑能夠顯著減少胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率，提高胃黏膜p-Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的表達(dá)，且p-Bcl-2/Bax比值顯著增加。結(jié)論:納達(dá)合劑保護(hù)胃黏膜的作用可能與其抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。

納達(dá)合劑;膽汁反流性胃炎;線粒體凋亡途徑

膽汁反流性胃炎(bile reflux gastritis，BRG)是由于多種原因?qū)е率改c胃反流(duodenogastricreflux，DGR)現(xiàn)象異常增多，引起胃黏膜損傷的一種疾?。?-2］。

DGR作為一種存在于機(jī)體內(nèi)的常見生理現(xiàn)象，其發(fā)生及反流量與胃十二指腸動(dòng)力異常以及幽門括約肌功能失常密切相關(guān)［3］。當(dāng)幽門括約肌功能異常，出現(xiàn)關(guān)閉不全時(shí)，十二指腸胃反流增加，其內(nèi)容物與胃黏膜長(zhǎng)時(shí)間接觸，最終導(dǎo)致胃黏膜損傷的發(fā)生，隨著病情的持續(xù)和進(jìn)展，引起胃黏膜的慢性炎癥、糜爛，更有甚者可以進(jìn)展為胃潰瘍［4-5］。

納達(dá)合劑是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院余莉芳老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，1995年開發(fā)為院內(nèi)制劑。本方功效為養(yǎng)陰清胃、降逆理氣，臨床應(yīng)用于慢性淺表性胃炎、BRG、非潰瘍性消化不良等疾病。大量的臨床實(shí)踐證明，其具有良好的治療作用。因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證納達(dá)合劑的療效并深入探討其作用機(jī)制，本研究通過大鼠BRG模型，觀察納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD清潔級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，恒溫(25 ±2)℃恒濕，人工光照12 h、黑暗12 h，自由進(jìn)食飲水。

1.2 主要試劑

納達(dá)合劑(由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供，滬藥制字Z05190757(批號(hào)14061901)，麥滋林(日本壽制藥株式會(huì)社)，牛膽酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)，胰酶、卵磷脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 (caspase3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9 (caspase9)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠、兔IgG(Cell signaling公司)，磷酸化B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(p-Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)(Bax)一抗(abcam公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)，一步法Tunel檢測(cè)試劑盒、組織線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位(JC-1)檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天公司)。反流液的配制:以牛膽酸鈉5 g、胰酶3 g、卵磷脂0.5 g溶于生理鹽水200 ml中。麥滋林的配制:將麥滋林(1袋0.67 g)溶于30 ml生理鹽水中，配制成約22 mg/ml的麥滋林藥液。

1.3 主要儀器

Var10skan Flash熒光酶標(biāo)儀(Thermo scientific公司)，Model 237型微板孵育器(Bio-Rad公司)，微型垂直電泳、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng) (Bio-Rad公司)，ChemiDocTM XRS+自動(dòng)顯影系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，電動(dòng)勻漿機(jī)(上海凈信科技有限公司)，Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal force公司)，DM2500型正置熒光顯微鏡(Leica公司)，KD-BM22型電腦生物組織包埋機(jī)(科迪儀器設(shè)備有限公司)，KD1508型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備、分組、給藥及取材方法［6，7］

BRG模型制備:根據(jù)大鼠體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、納達(dá)低劑量組、納達(dá)中劑量組、納達(dá)高劑量組、麥滋林組各10只共60只。大鼠給予15 ml/kg反流液灌胃造模8周，對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水。第5周起治療組分別給予納達(dá)合劑低劑量(12.75 g/kg)、納達(dá)合劑中劑量(25.5 g/ kg)、納達(dá)合劑高劑量(38.25 g/kg)及麥滋林(0.33 g/kg)以15 ml/kg灌胃，對(duì)照組與模型組給予同等體積的生理鹽水。給藥完畢后禁食不禁水24 h，烏拉坦腹腔麻醉后開腹摘取全胃，用生理鹽水漂洗后濾紙吸干剩余血液，并沿胃大彎側(cè)將胃剪開，去除胃內(nèi)容物后做常規(guī)胃竇標(biāo)本取材，一部分用4%多聚甲醛固定后用于石蠟切片的制作，一部分在液氮中浸泡30 min后置入－80℃冰箱長(zhǎng)期儲(chǔ)存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另外一部分在取材后4 h內(nèi)直接抽提組織線粒體，完成線粒體相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 胃黏膜病理組織學(xué)觀察 胃組織石蠟切片后采用HE染色法，高倍生物顯微鏡下(100X)觀察胃黏膜病理變化。

1.4.3 胃黏膜線粒體膜電位、ATP的測(cè)定(1)抽提胃黏膜線粒體:剪取50 mg新鮮的胃黏膜組織PBS洗滌，將組織塊置于冰上的離心管內(nèi)用剪刀剪碎，加入500 μl 4℃的含苯甲基磺酰氟(PMSF)的線粒體分離試劑A，電動(dòng)勻漿60 s/次共3次，將勻漿600 g4℃離心5 min。將上清液吸至新的EP管中，4℃離心11000 g 10 min。倒掉上清液，EP管中所剩之沉淀就是獲得的線粒體;(2)胃黏膜線粒體膜電位的測(cè)定:將分離的線粒體質(zhì)量懸于40 ul的線粒體貯存液中。再將JC-1工作液與JC-1染色緩沖液(1X)以1∶4的比例稀釋，取90 μl加入10ul重懸的線粒體。用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)檢測(cè)JC-1單體(綠光)時(shí)，將激發(fā)光與發(fā)射光分別設(shè)置為490 nm及530 nm波長(zhǎng);檢測(cè)JC-1聚合物(紅光)時(shí)，將激發(fā)光與發(fā)射光分別設(shè)置為525 nm及590 nm波長(zhǎng)，紅綠光比值即為線粒體膜電位值;(3)胃黏膜線粒體ATP的測(cè)定:將獲得的線粒體中加入100 ul ATP檢測(cè)裂解液充分震蕩，裂解后12000 g 4℃離心15 min取上清。用96孔板，毎孔加入100 ul ATP檢測(cè)工作液，室溫放置3～5 min。在檢測(cè)孔中毎孔加入50 μl待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品震蕩混勻，至少2 s后用熒光酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光模式檢測(cè)ATP含量，根據(jù)所得的ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本中ATP的濃度。用BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度，把 ATP濃度換算成 nmol/ mgprot的形式。

1.4.4 胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的測(cè)定 胃組織石蠟切片后，按照試劑盒說(shuō)明(一步法Tunel檢測(cè)試劑盒)檢測(cè)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況，高倍生物顯微鏡下(200X)記錄各病理切片各5個(gè)視野，按公式計(jì)算胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率。胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率=(凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總上皮細(xì)胞數(shù))×100%。

Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(Bax，p-Bcl-2，Bcl-2，caspase-3，cleaved-caspase-3，caspase-9 and cleaved-caspase-9)，按參考文獻(xiàn)［8］操作。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜病理組織學(xué)的改善作用

正常組胃黏膜厚度正常，上皮細(xì)胞及黏膜腺體排列規(guī)則整齊，大小形狀較為一致，未見脫落和缺損，腺上皮和腺管分界清楚。固有腺體及黏膜層無(wú)擴(kuò)張瘀血，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜肌層及間質(zhì)未見明顯異常。

模型組胃黏膜明顯變薄，胃黏膜上皮細(xì)胞破損、脫落，黏膜腺體不同程度破壞，腺體數(shù)量明顯減少，體積縮小明顯，排列無(wú)規(guī)則，胃黏膜充血水腫明顯，黏膜下小血管清晰可見，并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，以中重度炎癥表現(xiàn)為主。

納達(dá)合劑高劑量組胃黏膜厚度適中，結(jié)構(gòu)較為清晰，胃黏膜上皮細(xì)胞及黏膜腺體排列較為規(guī)則整齊，大小形態(tài)相對(duì)一致，未見明顯變性壞死。間質(zhì)及黏膜層有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，較為接近正常組胃黏膜。

納達(dá)合劑中、低劑量組胃黏膜厚度相對(duì)適中，結(jié)構(gòu)尚清晰，腺體排列稍欠規(guī)整，間質(zhì)及黏膜層可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有輕微的破損、脫落。

圖1顯示，麥滋林組胃黏膜破損、脫落較輕，結(jié)構(gòu)尚清晰，腺體間隙稍增寬，間質(zhì)及黏膜層有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜線粒體功能的影響

表1顯示，模型組與對(duì)照組比較，胃黏膜線粒體ATP含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);胃黏膜線粒體膜電位水平有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。納達(dá)合劑各劑量組及麥滋林顯著升高BRG大鼠胃黏膜線粒體ATP合成量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但對(duì)BRG大鼠胃黏膜線粒體膜電位水平的改善差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜線粒體ATP、膜電位及凋亡率的影響［例(%)］

2.3 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1、2和圖2、3顯示，模型組與對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞顯著增多(P＜0.01)，凋亡拮抗基因p-Bcl-2表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，凋亡啟動(dòng)蛋白cleavedcaspase-3、cleaved-caspase-9及凋亡促進(jìn)基因Bax表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)，且p-Bcl-2/Bax比值明顯下降(P＜0.01)。納達(dá)合劑呈劑量依賴性，抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，增加抑制凋亡蛋白的表達(dá)，減少胃黏膜上皮組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)，且p-Bcl-2/Bax比值明顯升高(P＜0.05)。

表2 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(目的蛋白/參照蛋白)

結(jié)果表明，納達(dá)合劑通過抑制線粒體凋亡途徑的作用可能是其抵御胃黏膜損傷的分子機(jī)制之一。

3 討論

在膽汁反流性胃炎的形成中，膽汁酸是造成黏膜損傷的主要成分。膽汁酸是親脂性類固醇，它具有很強(qiáng)的“皂化”特性，使胃黏膜屏障被損壞［9］，促使氫離子逆向彌散，刺激肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺，導(dǎo)致胃黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展。

在炎癥的刺激下，線粒體呼吸鏈?zhǔn)艿綋p傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加以及細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，從而促使大量的鈣離子向線粒體內(nèi)流，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)將持續(xù)性地開放，促使線粒體膜電位的喪失，釋放線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(Cytochrome C)。細(xì)胞色素C能夠與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)相結(jié)合，并形成多聚體，促使caspase-9與其結(jié)合成為凋亡小體，使caspase-9被激活，被活化的caspase-9又繼續(xù)激活下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7等，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡［10-12］。此外，凋亡還受許多基因調(diào)控，如Bcl-2和Bax分別具有抗凋亡及促凋亡的作用，Bax能與Bcl-2形成異源二聚體(Bcl-2-Bax，heterodimer)抑制凋亡，而且其自身還能形成同源二聚體(Bax-Bax，homodimer)誘導(dǎo)凋亡。Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/Bax)的比值，這對(duì)決定細(xì)胞凋亡的易感性起關(guān)鍵作用。

圖1 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜病理學(xué)改變的影響(HE×100)注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.納達(dá)低劑量組; D.納達(dá)中劑量組;E.納達(dá)高劑量組;F.麥滋林組;黑色箭頭標(biāo)示模型組胃黏膜顯著損傷與炎癥處

圖2 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜上皮凋亡的影響(Tunel×200)注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.納達(dá)低劑量組; D.納達(dá)中劑量組;E.納達(dá)高劑量組;F.麥滋林組;棕黑代表陽(yáng)性凋亡細(xì)胞(5視野/樣本)(黑色箭頭標(biāo)注為陽(yáng)性表達(dá))

圖3 納達(dá)合劑對(duì)BRG大鼠胃黏膜凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

當(dāng)前，西醫(yī)學(xué)治療BRG的常用藥物［13-14］有質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、促動(dòng)力藥、胃黏膜保護(hù)劑等。應(yīng)用以上幾類藥物可以在一定程度上緩解癥狀，但療效單一，往往需要配合使用，增加了出現(xiàn)藥物毒副作用的可能性。因此，余莉芳以胃陰不足型BGR的基本病因病機(jī)為切入點(diǎn)，綜合歷代醫(yī)家的治療經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合20余年對(duì)大量患者的臨床驗(yàn)證，形成經(jīng)驗(yàn)方納達(dá)合劑。方中北沙參、玉竹、麥冬、天花粉滋陰清熱潤(rùn)胃共為君藥;制半夏、代赭石、枳殼、木香、延胡索等理氣和胃，使動(dòng)靜結(jié)合、補(bǔ)而不膩共為臣藥;黃連、黃芩、蒲公英等苦寒之品清胃中郁熱共為佐藥;甘草調(diào)和諸藥為使［15-16］。全方共奏“養(yǎng)陰清胃、降逆理氣”之功效，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性淺表性胃炎、膽汁反流性胃炎和非潰瘍性消化不良等疾病。

本科室自1993年起對(duì)該方進(jìn)行臨床研究發(fā)現(xiàn)，納達(dá)合劑治療非潰瘍性消化不良62例總有效率達(dá)95.2%，并發(fā)現(xiàn)加味納達(dá)合劑對(duì)BRG合并黃疸亦具有良好的臨床療效［17-18］。因此，本研究擬采用大鼠BRG模型，觀察納達(dá)合劑能否通過抑制線粒體凋亡途徑改善BRG大鼠胃黏膜損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納達(dá)合劑能夠顯著提高BRG大鼠線粒體ATP合成量，但對(duì)線粒體膜電位無(wú)顯著影響，并能顯著減少BRG大鼠胃黏膜上皮組織中凋亡細(xì)胞百分比，促進(jìn)p-Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax、活化的caspase-3片段、活化的caspase-9片段的表達(dá)，增加p-Bcl-2/Bax比值。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)線粒體凋亡途徑參與了BRG中胃黏膜的損傷過程，而納達(dá)合劑可通過抑制線粒體凋亡途徑發(fā)揮胃黏膜保護(hù)效應(yīng)，這為臨床納達(dá)合劑治療BRG提供了現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步擴(kuò)大納達(dá)合劑的臨床適應(yīng)癥、加速納達(dá)合劑的臨床推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Gastric Mucosal Protective Functional Mechanism of Nada Decoction Based on Mitochondrial Apoptosis

LI Yong1，QUE Ren-ye1，SHEN Yan-ting1，LIN Liu-bing1，TAO Zhi-hui1，QIAN Chun-mei2
(1.Department of Gastroenterology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200071，China;2 Department of Central Laboratory，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200071，China)

Objective:To observe protective effect of Na Da Mixture on the Gastric Mucosal in BRG rats.Methods: SD rats were used and randomly divided into control group，model group，Na Da Mixture low group，Na Da Mixture middle group，Na Da Mixture high group and Marzulene group，10 rats per group.HE staining was used to observe the Pathological changes of gastric mucosa.JC-1 staining was used to observe the change of mitochondrial transmembrane potential.Chemiluminescence was used to observe the generation of mitochondrial ATP.Tunel staining was used to observe the apoptosis of gastric mucosal epithelial cells.Western blot analysis was used to detect the expression of Bax，p-Bcl-2，Bcl-2，caspase-3，cleaved-caspase-3，caspase-9 and cleaved-caspase-9.Results:HE staining showed that Na Da Mixture could significantly improve the pathological changes of gastric mucosa impaired in rats.Chemiluminescence showed Na Da Mixture could significantly increase the generation of mitochondrial ATP.JC-1 staining showed Na Da Mixture had no effect on mitochondrial transmembrane potential.Tunel staining showed Na Da Mixture could significantly reduce the apoptosis of gastric mucosal epithelial cells.Western blot analysis showed that Na Da Mixture could significantly increase the expression of p-Bcl-2，and decrease the expression of Bax，cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9，and the ratio of p-Bcl-2/Bax significantly increased.Conclusion:The effect of Na Da Mixture on protecting the gastric mucosa may be related to its inhibition of mitochondrial apoptosis pathway.

Na Da Mixture;Bile reflux gastritis;Mitochondrial apoptosis pathway

R573.1

B

1006-3250(2016)12-1625-04

2016-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573775)-基于ERβ-自噬途徑對(duì)ROS/NLRP3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控探討柴胡皂苷d抗肝纖維化作用機(jī)制;上海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(2011ZJ006)-納達(dá)合劑治療胃陰虧虛型慢性胃炎的藥效學(xué)及初步安全性評(píng)價(jià);上海市“新百人”人才計(jì)劃項(xiàng)目(XBR2013120)-柴胡皂苷d抗肝纖維化作用的雌激素受體機(jī)制

李 勇(1968-)，男，河南唐河人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事消化性疾病的臨床與基礎(chǔ)研究，Tel:18116070688，E-mail:liyong8256@126.com。