王 梓， 郝 迪，呂 楠，王 蕾

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

參附強(qiáng)心丸對(duì)心腎綜合征大鼠心腎Bcl-2/Bax抗凋亡作用機(jī)制研究*

王 梓， 郝 迪，呂 楠，王 蕾△

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

目的:基于大鼠心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)模型，探討參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心腎部位Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)及抗凋亡的作用機(jī)制。方法:采用腹主動(dòng)脈縮窄合并腎臟急性缺血再灌注致大鼠心腎綜合征模型，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組、參附強(qiáng)心丸高、中、低劑量組、卡托普利對(duì)照組6組，給藥4周后測(cè)定血液中腦鈉肽、醛固酮、肌酐等，計(jì)算左腎、心室臟器指數(shù)，TUNEL法測(cè)定心、腎凋亡，免疫組化測(cè)定心、腎Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果:模型組大鼠血漿腦鈉肽、醛固酮、肌酐、心室指數(shù)明顯高于假手術(shù)組，腎素活性、左腎指數(shù)明顯降低，組織凋亡明顯。參附強(qiáng)心丸中劑量組腦鈉肽、肌酐降低明顯;高劑量組醛固酮明顯降低，可明顯改善心肌肥厚及左腎壞死萎縮狀態(tài)，上調(diào)大鼠心腎組織Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，降低心、腎細(xì)胞凋亡率。結(jié)論:參附強(qiáng)心丸高、中劑量組可以改善CRS大鼠腎功能、水鈉潴留狀態(tài)，通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，降低心腎組織凋亡，起到對(duì)心腎的保護(hù)作用。

參附強(qiáng)心丸;心腎綜合征;腦鈉肽;細(xì)胞凋亡:Bcl-2;Bax;tunel

隨著社會(huì)老齡化發(fā)展進(jìn)程加快，慢性心臟疾病和腎臟病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，心力衰竭合并慢性腎功能不全發(fā)病率顯著增加，2005年荷蘭學(xué)者Bongartz提出“心腎綜合征”的概念，從而使得心腎綜合征(CRS)備受關(guān)注。本研究采用腎臟急性缺血再灌注損傷(RIRI)合并腹主動(dòng)脈縮窄(ACC)的手術(shù)方法制備大鼠“心腎共損”模型，旨在建立模擬臨床心腎綜合征病理特點(diǎn)的大鼠模型，探討參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心腎功能改善、細(xì)胞凋亡、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)等環(huán)節(jié)的作用機(jī)制，期望為其臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量290 g～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)SCXK-(軍)2009-003)。動(dòng)物飼養(yǎng)在室溫20～25℃、濕度30%～70%和明暗交替的環(huán)境中(12 h∶12 h)。

1.2 藥物、試劑及相關(guān)儀器

參附強(qiáng)心丸由天津中新藥業(yè)集團(tuán)達(dá)仁堂制藥廠提供，規(guī)格為1 g藥粉/g生藥(批號(hào)zj001)?？ㄍ衅绽?天津太平洋制藥有限公司，批號(hào)130102)，腦鈉肽試劑盒(南京建成科技有限公司，批號(hào)20141125)，TUNEL試劑盒(羅氏生物公司)。Bcl-2、Bax免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。PL203精密電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司制造)，科華ST360酶標(biāo)儀、生物組織包理機(jī) BMJ-1B、切片機(jī)LEICARM21351、顯微鏡OLYMPUS(日本OLYMPUS B071型顯微攝影器材)，IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 造模方法

采用腹主動(dòng)脈縮窄合并腎臟急性缺血再灌注損傷制備CRS大鼠模型。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射45mg/kg麻醉后，腹部正中切開(kāi)，沿腹白線(xiàn)進(jìn)入腹腔，暴露分離左右側(cè)腎蒂，阻斷結(jié)扎30 min后解除阻斷，恢復(fù)血流，造成急性缺血再灌注損傷。隨后暴露分離后腹膜，在左腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈。沿游離腹主動(dòng)脈長(zhǎng)軸置一折彎的7號(hào)針頭，以3-0絲線(xiàn)繞腹主動(dòng)脈后與7號(hào)針頭一起結(jié)扎，隨后立即抽出針頭，使腹主動(dòng)脈殘留直徑為0.7 mm的殘腔，造成腹主動(dòng)脈狹窄。假手術(shù)組只分離肌肉、血管，但不縮窄。術(shù)后腹腔內(nèi)滴入慶大霉素預(yù)防感染，分層關(guān)閉腹腔。

2.2 分組和給藥方法

將存活動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組、參附強(qiáng)心丸高劑量組(13.2 g/kg，相當(dāng)于人用劑量12倍)、參附強(qiáng)心丸中劑量組(6.6 g/kg，相當(dāng)于人用劑量6倍)、參附強(qiáng)心丸低劑量組(3.3 g/kg，相當(dāng)于人用劑量3倍)、卡托普利對(duì)照組(2.3 mg/kg，相當(dāng)于人用劑量6倍)。給藥組術(shù)后第9周開(kāi)始給藥，持續(xù)4周，假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃同體積飲用水。

2.3 標(biāo)本取材

大鼠稱(chēng)重，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后剪開(kāi)腹部，分離腹主動(dòng)脈，用一次性針管腹主動(dòng)脈取血，血液置于促凝管中測(cè)定血清腦鈉肽、肌酐、尿素氮;3 ml血液置于(0.3 mol依地酸二鈉30 μL，0.3 mol 8-羥基喹啉60μL，0.32 mol二巰基丙醇30 μL)抗凝測(cè)定血漿腎素活性、血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ;肝素抗凝測(cè)定血漿醛固酮。取血后將大鼠左腎、心臟摘除，分離左心室。臟器稱(chēng)重后放入福爾馬林溶液中固定，以備病理切片。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

2.4.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清腦鈉肽(BNP)，苦味酸法測(cè)定血清肌酐(Cr)，酶偶聯(lián)速率法測(cè)定血清尿素氮(Bun)，放射免疫法測(cè)定血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅰ(AT1)、血管緊張素Ⅱ(AT2)、醛固酮(ALD)含量。

2.4.2 大鼠心室、腎臟質(zhì)量指數(shù) 稱(chēng)量心室、全心濕重，計(jì)算心室、全心、腎臟指數(shù)。計(jì)算公式如下:心室指數(shù)=心室濕重/體質(zhì)量×100%;全心指數(shù)=全心濕重/體質(zhì)量×100%;腎臟指數(shù)=左腎濕重/體質(zhì)量×100%。

2.4.3 TUNEL法測(cè)定大鼠心肌、腎臟細(xì)胞凋亡 經(jīng)烤片、3 μm切片、脫蠟、梯度酒精水化，用proteinase K工作液處理、50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，PBS浸泡3次，滴加50 μL Converter POD試劑，PBS浸泡3次。每張切片加100 μL DAB工作液，顯微鏡下觀察隨時(shí)終止反應(yīng)，再經(jīng)自來(lái)水浸泡，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水浸泡、晾干，中性樹(shù)膠封固。計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率，凋亡率計(jì)算方法為同一個(gè)視野下，凋亡細(xì)胞占整體細(xì)胞數(shù)量的比重，IPP6.0計(jì)數(shù)計(jì)算。

2.4.4 免疫組化法測(cè)定大鼠心肌、腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取相應(yīng)部位的組織切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精入水后，采用免疫組化SABC法檢測(cè)大鼠心肌、腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)雜、脫水、透明、封片，細(xì)胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，采用軟件計(jì)算灰度值。

2.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 參附強(qiáng)心丸對(duì)血清BNP、Bun、Cr、PRA、AT1、AT2、ALD的影響

表1顯示，模型對(duì)照組BNP、Bun、Cr明顯高于假手術(shù)對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01);PRA、AT1、AT2明顯低于假手術(shù)對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.05)，表明該方法制備的CRS模型具備低腎素特點(diǎn)，而ALD明顯升高(P＜0.05)，表明模型對(duì)照組大鼠機(jī)體呈水鈉潴留狀態(tài)，參附強(qiáng)心高劑量組能夠改善CRS大鼠低腎素狀態(tài)與水鈉潴留狀態(tài)。

3.2 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心室、腎臟指數(shù)及細(xì)胞凋亡率的影響

表2顯示，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠心室指數(shù)明顯增加，左腎質(zhì)量明顯減小(P＜0.01)，參附強(qiáng)心丸中、低劑量組可明顯改善心肌肥厚(P＜0.05)。參附強(qiáng)心高、中劑量組可明顯改善左腎壞死萎縮狀態(tài)(P＜0.05)。

圖1顯示，模型組大鼠左心室、左腎凋亡率較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)細(xì)胞變圓，染色質(zhì)凝聚、分塊，胞質(zhì)皺縮。參附強(qiáng)心丸高、中劑量組可明顯抑制模型組大鼠心肌和腎臟細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)。

表1 參附強(qiáng)心丸對(duì)血清BNP、Bun、Cr、PRA、AT1、AT2、ALD的影響(±s)

表1 參附強(qiáng)心丸對(duì)血清BNP、Bun、Cr、PRA、AT1、AT2、ALD的影響(±s)

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較:★P＜0.05;★★P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) BNP (ng/L) Bun (mmol/L) Cr (μmol/L) PRA (ng/ml) AT1 (ng/ml) AT2 (pg/ml) ALD (ng/dl)假 手 術(shù) 對(duì) 照 組 10 444.17±59.04 5.90±0.82 29.71±5.05 4.96±2 2.27 10.15±5.00 1662.25±733.62 22.30±7.72 .32 12.49±4.52 1921.67±557.40 17.31±3.15模 型 對(duì) 照 組 10 535.00± 91.14★ 8.59±2.03★★ 40.00±9.38★ 2.11±1.59★★ 6.51±2.78★★1221.33±500.71★ 24.93±5.81★參附強(qiáng)心高劑量組 10 515.50±111.57 7.32±1.61 32.11±4.17▲ 2.90±2.24 11.20±5.77▲ 1461.00±704.94 19.87±3.58▲參附強(qiáng)心中劑量組 10 480.29± 63.21▲ 7.31±1.10 32.75±6.52▲ 2.43±1.29 11.40±5.32▲ 1678.00±542.53 20.65±2.48參附強(qiáng)心低劑量組 10 573.60±137.13 7.44±1.16 35.50±8.69 2.70±2.80 9.50±5.16 1500.00±593.10 22.09±6.73卡托普利對(duì)照組 10 511.42±108.58 6.97±1.50 31.86±7.95 2.72±

表2 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心室、左腎指數(shù)及細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

表2 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心室、左腎指數(shù)及細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較:★P＜0.05，★★P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 鼠數(shù) 心室指數(shù)(g/100 gBW) 全心指數(shù)(g/100 gBW) 左腎指數(shù)(g/100 gBW) 心肌凋亡率(%) 腎臟凋亡率(%)假 手 術(shù) 對(duì) 照 組 10 0.246±0.051 0.310±0.665 0.383±0.098 7.1±5.7 18.8±9.5模 型 對(duì) 照 組 10 0.312±0.023★★ 0.358±0.053 0.115±0.094★★ 31.2± 4.1★ 62.8±5.7★★參附強(qiáng)心高劑量組 10 0.307±0.027 0.360±0.024 0.239±0.128▲ 23.6±10.4 15.6±2.5▲▲參附強(qiáng)心中劑量組 10 0.271±0.035▲ 0.351±0.041 0.227±0.088▲ 20.8± 6.9▲▲ 24.6±4.7▲▲參附強(qiáng)心低劑量組 10 0.274±0.036▲ 0.334±0.039 0.183±0.110 22.5± 8.7 37.6±3.0▲卡托普利對(duì)照組 10 0.290±0.060 0.357±0.052 0.173±0.130 36.9± 4.1 12.0±6.1▲▲

圖1 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心肌、腎臟細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL×400)

3.3 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心肌、腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖2表3顯示，與模型對(duì)照組比較，參附強(qiáng)心丸高劑量組Bax、Bcl-2在左腎平均灰度均明顯增高(P＜0.05)，表明大鼠心、腎的抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)，促凋亡基因Bax表達(dá)下降，平均灰度數(shù)據(jù)。

表3 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心肌、腎臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(±s)

表3 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心肌、腎臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(±s)

注:與模型對(duì)照組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別Bcl-2模 型 對(duì) 照 組平均灰度/Dip左心室Bax 左腎Bax 左心室Bcl-2 左腎143.3± 5.5 114.3± 4.2 188.5±21.9 173.0±16.9參附強(qiáng)心高劑量組 160.5±12.1▲ 159.0± 2.2▲▲ 153.3± 9.4 145.2±14.8▲參附強(qiáng)心中劑量組 159.3±13.7 160.7± 8.3 168.5±21.9 169.5± 6.4參附強(qiáng)心低劑量組 138.0± 5.5 150.2±10.4 162.8±14.1 165.8± 6.2卡 托 普 利 對(duì) 照 組 164.3±14.4 166.5±14.4▲▲ 151.0±11.5▲150.5±12.4

4 討論

心臟和腎臟在神經(jīng)體液的共同調(diào)節(jié)下一起維護(hù)著血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定及各器官的血流灌注，兩者中其中1個(gè)器官的急慢性功能不全，導(dǎo)致另一器官急慢性功能不全稱(chēng)為心腎綜合征(CRS)［1］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，參附強(qiáng)心丸對(duì)慢性充血性心衰大鼠及犬的血流動(dòng)力參數(shù)和心肌纖維化的改善作用［2-3］，對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄致慢性心衰大鼠心肌Bcl-2表達(dá)上調(diào)起到抗心衰作用［4］。本研究在大鼠慢性心衰的模型基礎(chǔ)下建立“心損及腎、腎損及心”或“心腎共損”的CRS模型，闡明參附強(qiáng)心丸對(duì)腎臟和心臟的共同保護(hù)作用及作用機(jī)制，體現(xiàn)中醫(yī)“水火既濟(jì)”的基礎(chǔ)理論和益氣助陽(yáng)、強(qiáng)心利水的中醫(yī)治則。

目前，心衰模型主要采用手術(shù)致前后負(fù)荷加重，或冠狀動(dòng)脈結(jié)扎致缺血性心肌病，或心肌毒性化學(xué)物質(zhì)，或基因敲除等方法;腎衰模型多采用腎臟單側(cè)全腎或部分腎組織切除、腎蒂或腎動(dòng)脈永久結(jié)扎或缺血再灌、化學(xué)物質(zhì)合并腎臟切除術(shù)等方法。以往已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用合并手術(shù)方法造成心腎損傷程度大于單一手術(shù)的模型制備手段，多為大鼠急性心肌缺血合并腎組織切除術(shù)［5-7］，但對(duì)心腎損傷程度并不一致，穩(wěn)定性較差。本實(shí)驗(yàn)采用RIRI+ACC的手術(shù)方法制備大鼠“心腎共損”模型，模擬臨床心腎綜合征的病理特點(diǎn)。已有報(bào)道表明，RIRI可以導(dǎo)致由腎臟急性損傷轉(zhuǎn)歸為慢性腎損傷。RIRI+ACC可不同程度地增加慢性心衰和腎衰損傷程度［8-9］，該方法操作簡(jiǎn)單、手術(shù)過(guò)程可控，一致性較強(qiáng)。

BNP主要在心室合成，當(dāng)其在心室負(fù)荷過(guò)重或擴(kuò)張時(shí)合成會(huì)急速增加，可充分反映心室的功能狀態(tài)［10］，是反映心衰較新的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中，參附強(qiáng)心丸中劑量組可有效降低模型大鼠血清BNP濃度，通過(guò)提高CRS大鼠PRA、AT2含量，作用于RAAS系統(tǒng)，減少心室重構(gòu)，從而改善心功能。“水鈉潴留”用中醫(yī)病機(jī)可描述為“水飲內(nèi)停，陽(yáng)虛水泛”，臨床最明顯的體征為水腫，但動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)水腫的觀察欠直觀，ALD可反映機(jī)體水鈉潴留狀態(tài)，是觀察藥物利水的客觀指標(biāo)之一。參附強(qiáng)心丸高劑量組通過(guò)降低ALD水平，改善CRS大鼠水鈉潴留狀態(tài)，降低Cr、Bun，從而達(dá)到改善腎臟功能的作用。

CRS大鼠的腎臟處于缺血再灌注狀態(tài)，從而造成左腎壞死萎縮，急性腎衰經(jīng)過(guò)一段時(shí)間轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I衰。大鼠腹主動(dòng)脈縮窄后，心臟后負(fù)荷增加，心臟形成心室壁增厚的向心性肥厚，誘導(dǎo)心肌、腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11］，導(dǎo)致心肌細(xì)胞、腎臟細(xì)胞減少，這一過(guò)程受凋亡基因的調(diào)控，其中Bcl-2基因家族起著重要的作用［12］。Bcl-2基因家族中，Bcl-2主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+調(diào)控，控制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞凋亡;Bax蛋白可與Bcl-2蛋白形成異二聚體，使Bcl-2蛋白失活，因此對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用［13-14］，且二者相互作用。參附強(qiáng)心丸可增加CRS大鼠心腎部位Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，達(dá)到心腎保護(hù)和抗凋亡作用。

本實(shí)驗(yàn)中，參附強(qiáng)心丸高、中劑量能明顯改善CRS大鼠心肌肥厚和左腎壞死萎縮狀態(tài)，顯著降低CRS大鼠心肌和腎臟細(xì)胞凋亡率，有效增加CRS大鼠心腎Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而對(duì)CRS大鼠心腎有共同保護(hù)作用。

圖2 參附強(qiáng)心丸對(duì)CRS大鼠心臟、腎臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(×100)

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Effects of Shenfu Qiangxin Pill on Bcl-2/Bax Apoptosis in Rats with Cardiac and Renal Syndrome

WANG Zi，HAO Di，LV Nan，WANG Lei△

(Tianjin institute of medical and pharmaceutical sciences，Tianjin 300020，China)

Objective:Based on the cardiorenal syndrome rats model，to explore Shenfu Qiangxin(SFQX)pills of CRS in rat heart and kidney site of Bcl-2/Bax protein expression and anti apoptosis mechanism.Methods:A rat model of CRS was induced by ACC+RIRI.After operation，the CRS rats were randomly divided into 6 groups:Sham group，CRS model group，SFQX pills high、medium、low group and captopril group，Gavage rats 4 weeks，testing rats of BNP，ALD，Cr etc.Computed ventricular，heart，left renal index;Apoptosis of myocardium and kidney were measured by TUNEL and Bax and Bcl-2 protein expression in myocardium and kidney were measured by immunohistochemistry.Results:The CRS group BNP，Bun，Cr，ALD，ventricular index were higher than that of the sham group，PRA，AT1 and AT2，left renal index was significantly decreased，left ventricular and left renal tissue apoptosis.SFQX pills of BNP and Cr obviously decrease，can improve the low renin status of CRS rats;high group ALD decreased significantly; significantly improve myocardial hypertrophy，improve atrophy of left kidney necrosis，tune of CRS rats myocardial and kidney Bcl-2 expression and inhibition of Bax expression，reduce myocardial and renal cell apoptosis rate.Conclusion: SFQX pills can improve CRS rats renal function，sodium and water retention，by up regulating Bcl-2 protein expression and inhibiting the expression of Bax，reduce apoptosis of heart and kidney tissues to have a protective effect on the heart and kidney.

SFQX pills;CRS;BNP;Cell apoptosis，;Bcl-2;Bax;tunel

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1616-04

2016-04-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81202801)-(P)RR介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路對(duì)心腎綜合征聯(lián)動(dòng)作用及益氣溫陽(yáng)、活血利水治則機(jī)制研究

王 梓(1987-)，男，天津人，研究實(shí)習(xí)員，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事心腦血管藥理的臨床與研究。

△通訊作者:王 蕾(1979-)，女，天津人，副研究員，醫(yī)學(xué)碩士，Tel:13820803501，E-mail:zws9905@sina.com。