付文君，胡 勇，任香怡，魏江平，付 昆，徐世軍△

(1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137)

以腦能量轉(zhuǎn)運蛋白為靶點研究通絡(luò)醒腦泡騰片的抗癡呆作用*

付文君1，2，胡 勇1，2，任香怡1，2，魏江平1，2，付 昆1，2，徐世軍1，2△

(1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137)

目的:通過考察通絡(luò)醒腦泡騰片干預(yù)后MID模型大鼠海馬主要能量轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)揭示其抗癡呆的作用機(jī)制。方法:建立微血栓誘發(fā)的MID大鼠模型，給予通絡(luò)醒腦泡騰片干預(yù)90 d，采用Morris水迷宮評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，采用免疫組化和圖像分析法評價大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達(dá)。結(jié)果:與模型對照組比較，通絡(luò)醒腦泡騰片能顯著縮短MID模型大鼠的逃避潛伏期，增加進(jìn)入有效區(qū)域次數(shù)并延長有效區(qū)域停留時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;通絡(luò)醒腦泡騰片能顯著促進(jìn)模型大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2表達(dá)。結(jié)論:通絡(luò)醒腦泡騰片改善MID模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用與其促進(jìn)增強(qiáng)海馬能量轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達(dá)有關(guān)。

通絡(luò)醒腦泡騰片;多發(fā)腦梗死性癡呆;葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1;單羧酸轉(zhuǎn)運體-1;單羧酸轉(zhuǎn)運體-2

腦能量代謝障礙在阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病中具有極其重要的地位和作用［1-2］，且日益受到關(guān)注和重視。課題組前期提出，老年癡呆是一種腦能量代謝障礙啟動的神經(jīng)退行性疾病，腦能量代謝障礙貫穿于AD整個病程中，并發(fā)現(xiàn)Aβ海馬注射和雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎2種AD模型大鼠海馬中丙酮酸脫氫酶(PDH)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)活性顯著低下，表明該模型存在腦能量代謝障礙［3-4］。已知腦內(nèi)能量的來源主要是葡萄糖和糖原分解產(chǎn)物乳酸，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過內(nèi)皮細(xì)胞從血液中攝取葡萄糖，進(jìn)而可將能量代謝底物運送至神經(jīng)元［5-6］。葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1 (Glucose Transporter-1，GLUT-1)、單羧酸轉(zhuǎn)運體-1 (Monocarboxylate Transporter-1，MCT-1)、單羧酸轉(zhuǎn)運體-2(Monocarboxylate Transporter-2，MCT-2)是能量底物轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白，也是膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)運的重要紐帶，其表達(dá)也間接反映腦能量水平的高低［7-8］。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)醒腦泡騰片能改善東莨菪堿致癡呆小鼠模型、Aβ海馬注射大鼠模型和雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎模型的學(xué)習(xí)記憶功能，其作用與促進(jìn)細(xì)胞色素C氧化酶、PDH和α-KGDHC等環(huán)節(jié)有關(guān)［4，9］，表明通絡(luò)醒腦泡騰片具有改善癡呆模型腦能量代謝的作用，但其是否通過上述轉(zhuǎn)運體而發(fā)揮作用尚不清楚。為揭示其改善腦能量代謝的可能機(jī)制，本研究采用多發(fā)腦梗死性癡呆(multi-infarct dementia，MID)模型進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量280～320 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供(實驗動物合格證SCXK(川)2013-24)。

1.2 藥物與試劑

通絡(luò)醒腦泡騰片(1.2 g/片，含4.5 g原生藥/片)由四川同道堂藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供(批號20140215);甲磺酸雙氫麥角毒堿片(喜得鎮(zhèn))，天津華津制藥有限公司(批號3H878T);單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-1抗體(MCT-1)兔多克隆抗體(批號 bs-10249R)、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-2抗體(MCT-2)兔多克隆抗體(批號bs-3995R)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1抗體(GLUT-1)、兔多克隆抗體(批號bs-4855R)，均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供;二抗和DAB顯色試劑盒由北京中山金橋生物有限公司提供。

1.3 主要儀器

WMT-100 Morris水迷宮、Y迷宮，成都泰盟科技有限公司;BA200 Digital數(shù)碼三目攝像顯微系統(tǒng)，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 造模分組及行為測定

表1顯示，采用微血栓栓塞法制備MID大鼠模型［10］。大鼠麻醉后暴露左側(cè)頸動脈，分離出頸外動脈，從總動脈“Y”型分岔處緩慢注入0.4 ml含血栓的生理鹽水混懸液，注射后結(jié)扎頸外動脈近心端。假手術(shù)組動物注射生理鹽水，其余步驟與模型動物相同。造模后連續(xù)3 d肌注硫酸慶大霉素(0.1 ml/ 100 g)，10 d后采用“Y”迷宮［12］選取MID的模型(錯誤次數(shù)≥6)大鼠50只，隨機(jī)分成模型對照組、喜得鎮(zhèn)組(0.7 mg/kg)、通絡(luò)醒腦泡騰片高、中、低(7.56、3.78、1.89 g/kg)5組各10只，另隨機(jī)取10只注射生理鹽水的大鼠作為假手術(shù)組共6組;10 ml/kg灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)90 d，每日1次。給藥第86天時進(jìn)行Morris水迷宮實驗［11］，連續(xù)5 d，末次給藥后1 h測定大鼠逃避潛伏期、有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)及有效區(qū)域停留時間，評價大鼠學(xué)習(xí)記憶水平。

2.2 免疫組化法測定相關(guān)蛋白含量

Morris實驗結(jié)束后24 h麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取腦，石蠟包埋、切片，采用免疫組化SP法測定GLUT-1、MCT-1、MCT-2蛋白含量。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，并測定平均光密度(IA)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

與模型對照組比較，通絡(luò)醒腦泡騰片高、中、低3個劑量組大鼠的逃避潛伏期均顯著縮短，低劑量組進(jìn)入有效區(qū)域的次數(shù)顯著增多，進(jìn)入有效區(qū)域的停留時間顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響(±s)

表1 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較:#P＜0.05;與模型對照組比較:*P＜0.05

組別 鼠數(shù) 劑量g/kg 逃避潛伏期(s) 有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)(次) 有效區(qū)域停留時間(s)假 手 術(shù) 組 10 —11.40± 9.89 6.60±1.35 3.96±1.45模 型 對 照 組 10 — 72.06±47.12# 3.10±3.11# 1.60±1.95#喜 得 鎮(zhèn) 組 10 0.7mg 24.57±34.69* 6.30±2.87* 3.32±1.53*通 絡(luò)醒腦高劑量 組 10 7.56 50.87±39.37* 3.80±2.82 2.61±1.53通 絡(luò)醒腦中劑量 組 10 3.78 52.14±51.37* 5.00±4.90 2.79±2.39通 絡(luò)醒腦低劑量 組 10 1.89 29.81±28.85* 6.33±2.50* 3.46±1.71*

3.2 通絡(luò)醒腦泡騰片對模型大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2表達(dá)的影響

3.2.1 通絡(luò)醒腦泡騰片對 MID大鼠海馬GLUT-1蛋白表達(dá)的影響 GLUT-1陽性表達(dá)為淺黃色或棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜(圖1A)。圖1顯示，與假手術(shù)組比較，模型對照組海馬GLUT-1表達(dá)減少(P＜0.05);與模型對照組比較，通絡(luò)醒腦泡騰片高、中劑量組GLUT-1表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。

3.2.2 通絡(luò)醒腦泡騰片對 MID大鼠海馬MCT-1/MCT-2表達(dá)的影響 MCT-1、MCT-2主要表達(dá)于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜，陽性表達(dá)為淺黃色或棕黃色(圖2A和圖3A)。圖2、3顯示，與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠 MCT-1、MCT-2表達(dá)降低(P＜0.05);與模型對照組比較，通絡(luò)醒腦泡騰片3個劑量組的MCT-1表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，但MCT-2僅高劑量組較模型對照組顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

圖1 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID大鼠海馬GLUT-1表達(dá)的影響(×400)

圖2 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID大鼠海馬MCT-1表達(dá)的影響(×400)

AD的腦能量代謝下降首先出現(xiàn)于與記憶相關(guān)的腦區(qū)，如海馬和內(nèi)嗅皮層［12］，腦能量代謝主要涉及能量底物的運輸及細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝，而腦的必須和主要的能量代謝底物就是葡萄糖［13］。由于腦組織無法自身合成葡萄糖，因此葡萄糖的轉(zhuǎn)運在腦能量的供應(yīng)中居于關(guān)鍵地位。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦能量轉(zhuǎn)運中扮演著從血液中吸收葡萄糖并將能量代謝底物運送給神經(jīng)元的角色。眾所周知，ATP是能量的直接來源，三羧酸循環(huán)(TCA)是產(chǎn)生ATP的主要方式。丙酮酸作為TCA的中間產(chǎn)物，當(dāng)腦缺血缺氧狀態(tài)下，乳酸可經(jīng)乳酸脫氫酶-1(LDH-1)催化生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入TCA后合成ATP，促進(jìn)腦缺血損傷的快速修復(fù)［14］。在AD病理狀態(tài)下，GLUT1和GLUT3對于葡萄糖的運輸發(fā)揮著重要作用［15］。當(dāng)腦內(nèi)葡萄糖降低時，儲存于星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原被分解為乳酸，乳酸作為神經(jīng)元的功能物質(zhì)以維持神經(jīng)元的代謝［16-17］。大鼠腦缺血模型證明，腦缺血后乳酸成為主要的能量底物，加速修復(fù)缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷［18］，并在乳酸和葡萄糖同時存在時，神經(jīng)元更傾向于代謝乳酸［19］。但腦中的乳酸不能直接從血液中獲取，其來源于GLUT-1加速葡萄糖透過血腦屏障并經(jīng)GLUT-3轉(zhuǎn)運至神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，然后在LDH-5催化下生成［20］。生成的腦乳酸經(jīng)MCT-1/ MCT-4釋放到細(xì)胞間隙中，再經(jīng)MCT-2攝取至神經(jīng)元后由LDH-1催化成丙酮酸參與TCA供能［21］。

圖3 通絡(luò)醒腦泡騰片對MID大鼠海馬MCT-2表達(dá)的影響(×400)

本次研究結(jié)果表明，MID模型大鼠逃避潛伏期顯著延長，空間探索功能有障礙(有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)減少，有效區(qū)域停留時間縮短)，而海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2蛋白表達(dá)亦明顯減少。通絡(luò)醒腦泡騰片干預(yù)后，模型大鼠的逃避潛伏期縮短，有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)增多和停留時間延長，且海馬中GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達(dá)也顯著增高。上述研究結(jié)果與MCAO大鼠模型文獻(xiàn)［22-23］報道結(jié)果不一致。文獻(xiàn)認(rèn)為，MCAO大鼠腦組織中GLUT-1、MCTs表達(dá)明顯增強(qiáng)，并認(rèn)為可能與動物的代償反應(yīng)有關(guān)，高表達(dá)的GLUT-1、MCTs能夠通過提高腦能量轉(zhuǎn)運緩解缺血所造成的能量供應(yīng)不足［13-14］。造成結(jié)果不一致的原因，一是該文獻(xiàn)有再灌注損傷過程，提示腦缺血再灌注損傷后腦組織病理修復(fù)機(jī)制可能與多發(fā)性腦腔梗不同;二是本研究造模后持續(xù)給藥干預(yù)時間達(dá)3個月，病理損傷已經(jīng)為失代償期，長時間腦缺血損傷后僅依靠乳酸代謝產(chǎn)能可能無法維持大腦高耗能體系的運轉(zhuǎn)，當(dāng)腦內(nèi)能量逐步耗竭，能量底物轉(zhuǎn)運相關(guān)基因無法表達(dá)，蛋白質(zhì)合成受阻［1，24］，導(dǎo)致其表達(dá)降低，具體原因有待進(jìn)一步的深入研究。

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Anti Dementia Effects of Tongluo Xingnao Effervescent Tablet With the Target of Brain Energy Transporter

FU Wen-jun1，2，HU Yong1，2，REN Xiang-yi1，2，WEI Jiang-pin1，2，F(xiàn)U Kun1，2，XU Shi-jun1，2△
(1.Sichuan Provincial Key Laboratory，Systematic Research and Development of Chinese Medicinal Resources，Province-Ministry Co-constructed State Key Lab Incubation Base，Chengdu 611137，China; 2.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

Objective:To study the effect of Tongluoxingnao effervescent tablet(TLXNET)on the expression of energy transport-related proteins in multi-infarct dementia(MID)rats in order to explore its mechanism of anti-dementia.Methods:Microthrombus was used to establish MID model rats which were intervened by gastric infusion of TLXNET for 90 d.Evalneting the learning and memory ability of MID model rats via Morris water maze.Additionally the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 in hippocampal were measured by immunohistochemical and image analysis.Results: Compared with the model control group，TLXNET could significantly reduce the escape latency，increase times of entrance into the valid region and prolong the residence time of MID model rats，which all revealed a significant statistic;meanwhile the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 were notably raised after administration of TLXNET，with an increase in the average optical density.Conclusion:TLXNET can improve learning and memory deficit which is related with promoting the expression of energy metabolism-related proteins transportation such as GLUT-1，MCT-1 and MCT-2.

Tongluoxingnao effervescent tablet;Multi-infarct dementia;GLUT-1;MCT-1;MCT-2

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1612-04

2016-05-24

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09103002-008)-腦絡(luò)重塑治療老年癡呆新藥—通絡(luò)醒腦微丸的研究;四川省杰出青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人計劃項目(2011JQ0014)-芩芎當(dāng)歸解毒益智方對Aβ代謝的調(diào)控及機(jī)制研究;成都市產(chǎn)業(yè)發(fā)展技術(shù)支撐計劃—高校院所應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(12DXYB321JH-002)-通絡(luò)醒腦泡騰片抗老年癡呆的代謝組學(xué)及改善認(rèn)知的機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)研究

付文君(1992-)，女，新疆伊犁人，在讀碩士，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者:徐世軍(1975-)，男，甘肅靜寧人，教授，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)的臨床與研究，Tel:028-61800231，E-mail:docxu@126.com。