朱倩，崔毓桂

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京　210029)

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精子發(fā)生的調(diào)節(jié)機制及其進展

朱倩，崔毓桂*

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京210029)

【摘要】精子發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，受多種因素的精細調(diào)節(jié)以確保把正確的基因和表觀遺傳信息傳給子代，包括激素(如FSH、LH、T和E2等)、局部調(diào)節(jié)因子(如FGF9、SHP-2以及VEGF等)以及miRNAs的調(diào)節(jié)。本文將從精子發(fā)生的激素調(diào)節(jié)、睪丸內(nèi)的調(diào)節(jié)因子、miRNAs與精子發(fā)生關(guān)系等方面的研究進展進行綜述。

【關(guān)鍵詞】精子發(fā)生；生精細胞；支持細胞；激素；細胞因子；miRNAs

(JReprodMed2016，25(4)：378-383)

哺乳動物的精子發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，可分為3個階段：(1)精原細胞的自我更新和分化；(2)精母細胞減數(shù)分裂形成圓形精子細胞；(3)圓形精子細胞變態(tài)形成成熟的精子，即精子形成。新生小鼠睪丸生精上皮只有生殖母細胞和支持細胞。精子發(fā)生開始于出生后3 d，一部分生殖母細胞分化為分化型精原細胞，繼而分化為精母細胞、精子細胞并產(chǎn)生可生育的精子，即第一波精子發(fā)生；另一部分生殖母細胞分化為未分化型精原細胞，繼而分化為分化型精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子，形成穩(wěn)定的精子發(fā)生。精子發(fā)生是一個高效的過程，一個健康的男性每秒可以產(chǎn)生上千個精子。然而精子發(fā)生也是一個容易出錯的過程，人類精液中只有低比例的形態(tài)正常的精子。精子發(fā)生受多種因素的精細調(diào)節(jié)以確保把正確的基因和表觀遺傳信息傳給子代，包括激素、局部調(diào)節(jié)因子以及miRNAs的調(diào)節(jié)。本文綜述精子發(fā)生的激素調(diào)節(jié)和睪丸內(nèi)的局部調(diào)節(jié)，及其相關(guān)研究進展。

一、精子發(fā)生的激素調(diào)節(jié)

精子發(fā)生受多種激素的調(diào)節(jié)，主要有卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)和雌激素(E2)等。此外，其它激素也參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)，如胰島素[1-2]和甲狀腺激素[3]等。

1. FSH、LH、T調(diào)節(jié)精子發(fā)生

FSH和T是調(diào)節(jié)精子發(fā)生的主要激素，生精小管的支持細胞表達FSH受體和T受體，F(xiàn)SH在啟動精子發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，F(xiàn)SH和T則維持精子發(fā)生；LH通過T間接參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)，間質(zhì)中Leydig細胞表達LH受體。支持細胞與生殖細胞接觸最為密切，它們?yōu)樯臣毎峁I養(yǎng)和支持的作用，支持細胞的數(shù)目是決定成年期生精能力的主要因素。小鼠的支持細胞數(shù)目大約在出生后15 d就固定不變；T和FSH促進支持細胞的發(fā)育。在胎兒期，雄激素還通過作用于管周肌樣細胞(分泌管周肌樣細胞調(diào)節(jié)支持細胞因子，PModS)調(diào)節(jié)支持細胞的發(fā)育，而出生后主要是FSH調(diào)節(jié)支持細胞的發(fā)育。在性腺機能減退小鼠，出生后雄激素產(chǎn)生極少，但是胚胎期雄激素的產(chǎn)生是正常，因此出生時支持細胞的數(shù)目是正常的。T和FSH可以單獨調(diào)節(jié)精子發(fā)生也可以協(xié)同調(diào)節(jié)精子發(fā)生，支持細胞在激素調(diào)節(jié)中處于核心地位，而T對管周肌樣細胞的作用對正常精子的發(fā)生也是必須的[4]。因此，管周細胞在精子發(fā)生過程的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中也起到主要的作用。FSH對維持正常數(shù)量的精子發(fā)生是必不可少的。有研究報道促性腺激素缺乏的繼發(fā)性性腺功能減退癥的男性患者，在成功誘導(dǎo)精子發(fā)生后，僅使用絨毛膜促性腺激素(HCG)維持治療，雖然保持有精子發(fā)生，但產(chǎn)生的精子數(shù)量顯著減少[5]。卵泡刺激素受體(FSHR)和FSHβ敲除的小鼠能完成低水平的精子發(fā)生。這些結(jié)果提示FSH對維持正常數(shù)量的精子發(fā)生是必不可少的。精子發(fā)生的早期階段主要受FSH調(diào)節(jié)，而晚期階段主要受T調(diào)節(jié)。在對嚙齒類動物和猴的研究中發(fā)現(xiàn)，精原細胞的發(fā)育以及減數(shù)分裂的起始主要受FSH的調(diào)節(jié)，而減數(shù)分裂的完成、精子形成主要受睪丸內(nèi)T的調(diào)節(jié)；精子釋放過程需要FSH和睪丸內(nèi)T共同調(diào)節(jié)而T的作用更為重要。FSH維持粗線期精母細胞的數(shù)量，HCG能夠促進粗線期精母細胞向圓形精子細胞的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的完成[6]。黃體生成素受體(LHR)敲除的小鼠精子發(fā)生停滯在圓形精子細胞階段；LHβ敲除的小鼠精子發(fā)生停滯在圓形精子細胞階段，長形精子細胞和晚期的精子細胞缺乏，提示FSH和睪丸內(nèi)少量的睪酮不能使精子發(fā)生越過圓形精子細胞階段[7]。但是只有FSH而沒有睪丸內(nèi)少量的睪酮作用時，F(xiàn)SH能增加精原細胞和精母細胞的數(shù)量，促進減數(shù)分裂的開始，但不能促進減數(shù)分裂的完成，不能形成精子細胞[8]。雄激素受體(AR)完全敲除的小鼠精子發(fā)生阻滯在粗線期精母細胞；特異性敲除支持細胞上的AR精子發(fā)生阻滯在精母細胞階段或早期精子細胞階段。

2. E2調(diào)節(jié)精子發(fā)生

睪丸網(wǎng)液中有高濃度的E2，大鼠附睪中E2水平是血漿中的25倍，提示E2在精子發(fā)生和精子成熟中發(fā)揮某些作用。在未成熟期，雌激素主要由支持細胞產(chǎn)生；在成年期間質(zhì)細胞是合成雌激素的主要場所。低濃度的E2對正常的精子發(fā)生是必須的。T對促性腺激素的反饋調(diào)節(jié)主要是通過芳香化后所產(chǎn)生的E2發(fā)揮作用。雌激素幾乎參與精子發(fā)生的所有過程。E2能夠促進原始生殖細胞[9]、生殖母細胞[10]和精原細胞的增殖[11-12]、精母細胞成熟、精子細胞分化、精子成熟和釋放。在未成熟嚙齒動物的睪丸，支持細胞里的芳香化酶(Ar)活性高，在成年期則間質(zhì)細胞中的芳香化酶活性最高。生精細胞中也有芳香化酶存在，芳香化酶表達于粗線期、晚期精母細胞、精子細胞和精子。ER廣泛分布于男性生殖道，ER有2個亞型即ERα和ERβ，但它們在睪丸細胞中的準確定位還存在爭議。人類睪丸生精細胞、支持細胞、間質(zhì)細胞中都有ERα和ERβ表達，也有文獻報道ERβ是男性睪丸中的唯一雌激素受體。芳香化酶或雌激素受體(ER)缺乏時，雄性生殖功將明顯受影響。在ArKO的雄性小鼠1年后都發(fā)生不育，精子發(fā)生阻滯在精子細胞階段，圓形精子細胞和長形精子細胞減少了50%。在hpg小鼠E2通過ERα提高血漿FSH的水平，誘導(dǎo)精子發(fā)生，雄激素受體在這一過程中也發(fā)揮著重要的作用[13]。ERα還與生精小管液的重吸收有關(guān)，ERα敲除的雄性小鼠，輸出小管中的液體重吸收障礙，使得精子被稀釋，生精小管中的壓力升高，生精上皮萎縮，精子發(fā)生障礙，小鼠不育。ERβ敲除的雄性小鼠也是不育的[14]。

研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)是E2調(diào)節(jié)精子發(fā)生的另一個重要的雌激素受體。Chimento等[15]通過原代培養(yǎng)的粗線期精母細胞發(fā)現(xiàn)ERα、ERβ和GPR30表達于粗線期精母細胞，且GPR30主要存在于細胞的胞漿中。E2通過ERα和GPR30，激活EGFR/ERK/c-Jun信號通路，調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的基因的表達。這3種受體在精母細胞(GC-2)中也都有表達，且GPR30主要存在于胞漿和胞膜中。E2通過ERα和GPR30，激活ERK1/2、JNK和p38，進而激活線粒體凋亡通路[16]。Chimento等[17]研究還發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的大鼠圓形精子細胞中，也都有這3種受體的表達，GPR30也主要表達于胞漿中。E2通過ERα、ERβ和GPR30，激活EGFR/ERK調(diào)節(jié)細胞分化和凋亡的基因的表達，如cyclin B1和Bax。

二、睪丸內(nèi)的調(diào)節(jié)因子

精子發(fā)生的睪丸內(nèi)細胞因子的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，此處僅例舉成纖維細胞生長因子9 (FGF9)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的作用。

1. FGF9：FGF9最早發(fā)現(xiàn)于人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，它是多種細胞的有絲分裂和存活因子，具有多種生物功能包括神經(jīng)發(fā)育、性別分化、骨形成、晶狀體纖維分化和縫隙連接形成。FGF9是成纖維細胞生長因子家族的成員之一。成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)是酪氨酸激酶型受體，有8種類型，即FGFR1Ⅲb，F(xiàn)GFR1ⅢC，F(xiàn)GFR2Ⅲb，F(xiàn)GFR2Ⅲc，F(xiàn)GFR3Ⅲb，F(xiàn)GFR3Ⅲc，F(xiàn)GFR4和FGFR5。其中FGF9與FGFR2Ⅲc，F(xiàn)GFR3Ⅲb，F(xiàn)GFR3Ⅲc 以及FGFR4結(jié)合。

有研究發(fā)現(xiàn)11.5 d.p.c的.FGF9表達于XX和XY未分化的性腺中，但在12.5 d.p.c.它局限于XY性腺中，然后表達于睪丸軸。FGF9在胚胎期的睪丸發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，是雄性性別決定必需的信號分子，它參與性腺細胞增殖、Sertoli細胞分化以及中腎細胞遷移，F(xiàn)GF9敲除的小鼠支持細胞分化停止并發(fā)生雄性向雌性的性反轉(zhuǎn)。DiNapoli等[18]發(fā)現(xiàn)FGF9敲除的胎兒睪丸，12.5 d.p.c.時大部分生殖細胞丟失，而存活的生殖母細胞發(fā)生了減數(shù)分裂，提示FGF9是生殖細胞的存活因子并且抑制胎兒睪丸生殖細胞的減數(shù)分裂。FGF9抑制胎兒生殖細胞的減數(shù)分裂，并促進生殖細胞向雄性方向發(fā)育[19]。此外，F(xiàn)GF9在出生后睪丸的發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用。FGF9也能抑制出生后睪丸生精細胞的減數(shù)分裂。Nanos2是RNA結(jié)合蛋白，它能沉默精原細胞分化和進入減數(shù)分裂的基因，而FGF9增加減數(shù)分裂前精原細胞中的Nanos2水平抑制減數(shù)分裂[20]。Tassinari等[21]研究表明FGF9激活ERK，激活Cripto-Nodal-Smad2/3通路，促進Nanos2表達而抑制Stra8和Scp3的表達，抑制出生后精原細胞的減數(shù)分裂。Lin等[22]研究發(fā)現(xiàn)FGF9與睪酮生成密切相關(guān)，F(xiàn)GF9 和FGFR 亞型(FGFR2Ⅲc，F(xiàn)GFR3 和FGFR4) 的mRNA 均表達于小鼠睪丸間質(zhì)細胞，并通過Ras-MAPK，PI3K 和PKA 信號通路調(diào)節(jié)睪酮的合成。

2. SHP-2：SHP-2是一種在生物體內(nèi)普遍存在的具有去磷酸化作用的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)，由PTPN11 基因編碼。SHP-2作為細胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號分子，在細胞的生長分化以及腫瘤細胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用。

在人類，SHP-2突變會引起豹皮綜合征(LS)和努南綜合征(NS)，這2種綜合癥都有男性不育。Purip等研究發(fā)現(xiàn)SHP-2在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。SHP-2在支持細胞發(fā)育過程中穩(wěn)定地表達。在成年大鼠的睪丸中SHP-2表達于支持細胞核、生精細胞間直到生精小管管腔以及圍繞長形精子細胞的支持細胞胞漿、靠近基底膜的血睪屏障區(qū)域以及精原細胞。血睪屏障在精子發(fā)生中發(fā)揮著必不可少的作用，它是相鄰的支持細胞間的大的連接復(fù)合體，包括緊密連接、粘著連接、縫隙連接。SHP-2是血睪屏障和精子細胞-支持細胞粘附的一個重要的調(diào)節(jié)因子。SHP-2作為肝細胞生長因子(HGF)的下游因子調(diào)節(jié)血睪屏障的功能。SHP-2能夠通過Src激酶上調(diào)ERK1/2的活性，而ERK1/2的激活能夠破壞血睪屏障。局部粘著激酶(FAK)是維持血睪屏障完整性的重要調(diào)節(jié)因子，它可以與SHP-2相互結(jié)合，SHP-2能夠減少FAK的酪氨酸磷酸化。超表達SHP-2能夠使緊密連接和粘著連接的完整性缺失、肌動蛋白細胞骨架裂解以及緊密連接和粘著連接蛋白N-cadherin、β-catenin，和ZO-1錯誤定位[23]。SHP-2參與膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)信號通路調(diào)節(jié)精原干細胞的增殖與存活。缺乏SHP-2使得精原干細胞增殖和存活發(fā)生障礙，不能產(chǎn)生未分化的精原細胞，精子發(fā)生被阻滯在起始階段，但是未分化精原細胞以后的生精細胞能夠完成精子發(fā)生，因此SHP-2在精原干細胞的發(fā)育中發(fā)揮著必不可少的作用[24]。

3. VEGF：VEGF家族是一類多功能的細胞因子，由于能夠有效的刺激內(nèi)皮細胞有絲分裂和誘導(dǎo)血管生成而得名。該家族有7個成員：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F及胎盤生長因子(PIGF)，三種受體：VEGFR-1，VEGFR-2及VEGFR-3. 在促進內(nèi)皮細胞增值、存活和分化中VEGF-A 發(fā)揮最為重要的作用。VEGF-A基因由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成，通過基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的不同剪切方式產(chǎn)生許多亞型，包括VEGFA121、VEGFA145、VEGFA165和VEGFA206等。VEGF-A主要與FLT1 (即 VEGFR1)和KDR (即VEGFR2或FLK1)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。

VEGF，特別是VEGF-A，對男性生殖具有重要作用。它通過自分泌和旁分泌的方式，調(diào)節(jié)男性生殖系統(tǒng)各器官血管生成、睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞功能以及睪丸激素生成，對精子的發(fā)生、發(fā)育及成熟產(chǎn)生重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A表達于支持細胞、間質(zhì)細胞、生殖母細胞、精原細胞、精母細胞以及精子中。VEGF-A也表達于前列腺、精囊和精液中；在人、大鼠、小鼠和牛的睪丸生殖細胞中都有VEGFR2表達。支持細胞和生殖細胞分泌的VEGF-A對未分化精原細胞的維持、精子的數(shù)目和正常的男性生殖是必不可少的。敲除支持細胞和生殖細胞中的VEGF-A，小鼠的體重、附睪以及前列腺的重量減輕，改變了細胞凋亡和調(diào)節(jié)未分化精原細胞功能的基因，未分化精原細胞的數(shù)量減少，精子數(shù)目的減少，降低了小鼠的生育力[25]。VEGF-A調(diào)節(jié)鹿的精原細胞的增殖和精子形成[26]。Caires 等[27]運用SSC 移植技術(shù)證明了VEGFA在精原干細胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，VEGF-A164促進精原干細胞的自我更新，而 VEGFA165b促進精原干細胞的分化，VEGF-A 亞型的平衡對于精原干細胞池和男性生殖是非常重要的。用單細胞懸液從頭形成睪丸組織時，添加VEGF-A 165不能增加血管和生精小管的形成，但是它能增加每個生精小管中精原細胞的含量，對生殖細胞的形成具有保護作用[28]。

三、miRNAs與精子發(fā)生

miRNAs是一類小的非編碼單鏈RNAs，由20～25核苷酸組成。它通過使mRNAs降解或抑制蛋白翻譯參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。大量的研究證明miRNAs與精子發(fā)生密切相關(guān)。大量的miRNAs表達于生精細胞中，在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。miRNAs調(diào)節(jié)精原細胞的自我更新和分化。miR20 和miR106a在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)STAT和Ccnd1，調(diào)節(jié)精原干細胞的自我更新[29]。miR135a通過Foxo1調(diào)節(jié)精原干細胞的功能[30]。miR-544抑制PLZF的表達，調(diào)節(jié)雄性生殖干細胞(mGSC)的自我更新和分化[31]。miR-146在小鼠未分化的精原細胞中高表達，它參與維甲酸誘導(dǎo)的精原細胞的分化[32]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)抑制未分化精原細胞的miR-221/222可以誘導(dǎo)精原細胞的分化，而超表達miR-221/222抑制精原細胞的分化，miR-221/222通過抑制KIT的表達維持哺乳動物精原細胞的未分化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在減數(shù)分裂以及減數(shù)分裂后的生殖細胞中也是必不可少的。例如，miR-34c表達于精母細胞和圓形精子細胞.抑制初級精母細胞中的miR-34c能夠增加Bcl-2/Bax的比值，抑制睪酮缺乏誘導(dǎo)的生殖細胞凋亡。超表達miR-34c誘導(dǎo)GC-2細胞凋亡，抑制miR-34c可降低GC-2細胞凋亡，miR-34c促進雄性生殖細胞凋亡是通過ATF1(轉(zhuǎn)錄激活因子1)發(fā)揮作用的[34]。Bao 等[35]研究表明 miR-449也表達于精母細胞和精子細胞，在睪丸發(fā)育和成年后的減數(shù)分裂開始時表達量增加。CREM和SOX5調(diào)節(jié)減數(shù)分裂及減數(shù)分裂后的miR-449的活性，在miR-449敲除的小鼠發(fā)育和精子發(fā)生都是正常的，但miR-34b/c的表達是增加，miR-34b/c可以補償miR-449的功能，二者通過E2F-pRb途徑調(diào)節(jié)男性生殖細胞的發(fā)育。但是miR-449和miR-34b/c都敲除的小鼠精子發(fā)生嚴重受損，出現(xiàn)少弱畸精子癥，引起不育[36-37]。再例如，過渡蛋白2(TNP2)和魚精蛋白2(PRM2)是調(diào)節(jié)精子形成過程中染色質(zhì)凝集和壓縮的重要因子；miR469能夠抑制TNP2和PRM2蛋白的翻譯，影響正常精子的產(chǎn)生[38]。miRNAs參與精子發(fā)生調(diào)節(jié)及其機制，是當前男科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。

四、結(jié)論與展望

精子發(fā)生涉及激素、局部調(diào)節(jié)因子等多種因素的調(diào)節(jié)，近年發(fā)現(xiàn)miRNAs參與調(diào)節(jié)作用。越來越多的精子發(fā)生調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，大大豐富了我們對精子發(fā)生及相關(guān)機制的認識，對治療男性不育癥和男性避孕具有重大的意義。

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[編輯：郭永]

Research progress of regulatory mechanism of spermatogenesis

ZHUQian，CUIYu-gui*

ClinicalCenterofReproductiveMedicine,FirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029

【Abstract】Spermatogenesis is a complex process, and it is strictly regulated for correct transmission of genetic and epigenetic information to subsequent generation. FSH, LH, T and E2 are the main hormones that regulate spermatogenesis. Apart from the hormones, some local regulators, such as FGF9, SHP-2 and VEGF etc., as well as miRNAs also play important roles in regulation of spermatogenesis. The research progress of hormone regulation, cytokine in testis, and miRNA related with spermatogenesis was reviewed in this paper.

【Keywords】Spermatogenesis;Germ cells;Sertoli cells;Hormones;Cytokines;miRNAs

【作者簡介】朱倩，女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者，Email：cuiygnj@njmu.edu.cn)

【基金項目】國家自然科學(xué)基金(81370754，81170559)；江蘇省衛(wèi)生廳科教興衛(wèi)工程(ZX201110)

【收稿日期】2015-06-30；【修回日期】2015-08-25

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.04.018