譚國超　徐春娟　馬紀龍

721006 寶雞，解放軍第三醫(yī)院石壩河分院1

邊　靜1　溫　煜1　來力偉1

張方琪2　成家軍2

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·論著·

我國西部漢族人IL-10基因多態(tài)性與肺結核易感性的相關性研究

譚國超1徐春娟1馬紀龍1

721006 寶雞，解放軍第三醫(yī)院石壩河分院1

邊靜1溫煜1來力偉1

張方琪2成家軍2

【摘要】目的探討白介素-10(IL-10)基因單核苷酸多態(tài)性與肺結核易感性的相關性，為肺結核的早期預警提供新的候選分子標志物。方法檢測147例肺結核患者(病例組)及206例健康個體(對照組)中IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)多態(tài)位點基因型，進行關聯(lián)分析。結果樣本均衡性檢驗顯示病例組與對照組個體之間在性別(P=0.575)、年齡(P=0.840)分布無統(tǒng)計學差異；基因分型檢出率為99.7%；哈德溫伯格平衡檢測顯示對照組個體符合遺傳學規(guī)律(P值分別為0.137與0.311)；-819位點CC、CT、TT基因型分布在病例組與對照組間無統(tǒng)計學差異(P=0.901)；-1 082多態(tài)位點AA、AG、GG基因型在病例組中的分布頻率分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，二者之間存在統(tǒng)計學差異(P=0.032)，G為風險等位基因(OR=1.55, 95%CI 1.10～2.19)。結論IL-10基因-1 802(A>G)位點單核苷酸多態(tài)性與我國西部漢族人群肺結核易感性顯著相關，可作為該地區(qū)肺結核早期預警篩查的候選分子標志物。

【關鍵詞】肺結核；白介素-10；單核苷酸多態(tài)性

結核病(tuberculosis, TB)是一類由結核分枝桿菌引起的、多發(fā)的、在許多情況下能夠致死的傳染性疾病，大多發(fā)生在肺部。我國是肺結核的高發(fā)地區(qū)，每年發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病總人數(shù)的11%，居世界第二位，尤以西部地區(qū)和農村地區(qū)疫情最為嚴重。結核病的易感性與嚴重程度與多種因素相關[1-2]。有研究報道細胞因子基因如白介素-10(IL-10)多態(tài)性與肺結核易感性之間存在相關性，但這種關聯(lián)存在地域和人種的差異。本研究采用病例對照方法，對我國西部漢族人群肺結核易感性與IL-10基因單核苷酸多態(tài)性的相關性進行了關聯(lián)分析，旨在為該地區(qū)提供肺結核早期預警篩查的候選分子標志物。

資料與方法

一、研究對象

選取2013年2月至2015年2月寶雞市解放軍第三醫(yī)院石壩河分院結核科收治的肺結核患者147例為病例組，206例同期來院體檢的健康個體為對照組。病例組年齡分布為26~75歲，平均(55.4±12.4)歲，其中男性87例，女例60例。對照組年齡分布為23~72歲，平均(55.7±12.1)歲，其中男性128例，女性78例?？紤]到環(huán)境與遺傳因素對肺結核易感性的影響，所有研究對象均為寶雞市及陜西省常住漢族人口(居住5年以上)，標本采集嚴格遵守知情同意原則。

二、研究方法

采用病例對照方法分析IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)位點單核苷酸多態(tài)性與研究對象肺結核易感性的相關性。采用北京天根生物技術公司全血基因組DNA提取試劑盒對研究對象外周血樣本進行基因組DNA提取，所得標本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂镁酆厦告湻磻蛄刑禺愋砸?PCR-SSP)對IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點進行基因分型。

三、統(tǒng)計學方法

采用χ2檢驗、t檢驗對病例組與對照組樣本均衡性進行檢驗；采用哈德溫伯格平衡檢驗分析對照組個體是否符合遺傳學定律；比較病例組與對照組之間基因型、等位基因分布是否存在差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、 樣本均衡性檢驗

表1所示為病例組和對照組的一般情況。共納入肺結核患者147例(病例組)，健康個體206例(對照組)。病例組平均年齡55.4歲，對照組平均年齡55.7歲，兩組無統(tǒng)計學差異(P=0.840)；病例組中男性87例(59.2%)、女性60例(40.8%)，對照組中男性128例(62.1%)、女性78例(37.9%)，兩組無統(tǒng)計學差異(P=0.575)。

二、基因分型

對提取的DNA樣本進行基因分型，819(C>T)位點在病例組與對照組中分別檢出147例與206例，1 802(A>G)位點分別檢出146例與205例，總檢出率達99.7%。哈德溫伯格平衡檢測兩位點在對照組中的基因型分布，P值分別為0.137與0.311，顯示對照樣本符合遺傳學規(guī)律, 見表2。

表1　病例組和對照組一般情況

表2　IL-10基因-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點基因

三、候選位點多態(tài)性與肺結核易感性之間的相關性分析

比較病例組與對照組之間-819(C>T)、-1 082(A>G)兩位點在基因型、等位基因分布頻率之間的差異。發(fā)現(xiàn)-819(C>T)的CC、CT、TT三種基因型在病例組中所占比例分別為34.0%、51.7%和14.3%，在對照組中所占比例分別為35%、52.4%和12.6%，在兩組間無顯著差異(表3，P=0.901)。-1 082(A>G)AA、AG、GG三種基因型在病例組中所占比例分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，兩組在基因型與等位基因分布均有顯著差異(表3，P值分別為0.032和0.012)，其中G為風險等位基因(OR=1.55, 95%CI1.10～2.19)。

表3　IL-10基因-819(C>T)、 -1 082(A>G)兩位點等

討論

本研究旨在探索以IL-10為代表的細胞因子單核苷酸多態(tài)性與我國西部漢族人群肺結核易感性的相關性，通過采用病例對照研究方法，入組了147例肺結核患者(病例組)和206例健康個體(對照組)，對其外周血樣本進行核酸提取、基因分型與關聯(lián)分析。結果顯示，IL-10基因-1 082(A>G)位點單核苷酸多態(tài)性與我國西部漢族人群肺結核易感性顯著相關，為該地區(qū)肺結核的預警與早期診斷提供了新的候選分子標志物。

肺結核是一類由結核分枝桿菌引起的多發(fā)性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是全世界致死率最高的傳染性疾病之一。2010年我國新增肺結核病例數(shù)約100萬，占全球發(fā)病總人數(shù)的11%，居世界第二位。已知肺結核易感性與多種因素相關。其中最受關注的是HIV病毒，約13%的肺結核患者是HIV感染者。肺結核還是貧困相關的主要疾病之一，受地區(qū)經濟狀況影響明顯，人群的擁擠程度和營養(yǎng)狀況與肺結核發(fā)病率顯著相關[3]。慢性肺部疾病也是肺結核感染的另一高危因素，矽肺能夠使肺結核發(fā)病風險提高近30倍[4]。而吸煙者患肺結核的風險是非吸煙者的近2倍。2012年進行的一項meta分析則表明，在同一人群中年輕人比老年人更易患肺結核[5]。

而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在結核分枝桿菌感染者中只有約10%的人群會發(fā)展為活動性肺結核[6]。因此，環(huán)境——病原微生物——宿主遺傳易感性之間相互作用引發(fā)肺結核的模式越來越被人們所認可。近年來，多項研究表明個體遺傳因素與肺結核易感性之間存在著顯著關聯(lián)，包括領養(yǎng)研究、雙胞胎研究、全基因組連鎖研究、病例—對照關聯(lián)研究等。由于目前仍沒有關于肺結核病開展的全基因組關聯(lián)研究數(shù)據可供解讀，所以候選基因策略由于其低成本、尤其在探索低等位基因頻率易感基因的作用中仍然具有很好的應用前景。我國西部地區(qū)是肺結核高發(fā)區(qū)，針對我國西部地區(qū)開展肺結核易感性與候選基因多態(tài)性的關聯(lián)研究，以鑒定出特異、高效的分子標志物是目前亟待解決的問題。

大量關聯(lián)研究結果顯示，結核患者的病理狀態(tài)與某些促炎、細胞因子的上調或下調相關聯(lián)[7]，而位于細胞因子基因啟動子和編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性位點能夠通過改變所在基因的轉錄活性而影響分泌[8]。在發(fā)病部位中由于T淋巴細胞與被感染的巨噬細胞的相互作用而產生的細胞因子對于肺結核的發(fā)病機制起到了重要作用[9]。結核分枝桿菌感染宿主細胞的過程受到2種T細胞輔助因子的調節(jié)。其中，T細胞輔助因子1(IL-2和IFN-γ)與抗感染相關，而T細胞輔助因子2(IL-4和IL-13)被認為與疾病的發(fā)展相關[10]。

IL-10是一種具有多重功能的細胞因子，最初發(fā)現(xiàn)能夠抑制小鼠Th1細胞IFN-γ的0合成，而被認為具有抑制細胞因子合成的作用[11]。IL-10能夠在炎癥發(fā)生過程中通過下調促炎細胞因子IL-12和TNF-α的表達，從而起到抑制單核/巨噬細胞的作用，并能抑制主要組織相容性復合體Ⅱ在細胞表面的表達[12]。IL-10還可以抑制CD4+的T細胞對IL-8的趨化作用[11]，并通過上調Bcl-2的表達抑制T細胞的凋亡[13]。近期研究表明，IL-10對T細胞的抑制作用能夠通過阻斷CD28分子的信號通路以及隨后的磷脂酰肌醇3-激酶的活化來完成[14]。作為T細胞調節(jié)因子之一，IL-10被認為可能在慢性/潛伏期肺結核的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在小鼠體內，上調其表達能夠促進慢性肺結核的激活并抑制細胞免疫對胞內感染的抵抗[15]。

據文獻報道，IL-10基因單核苷酸多態(tài)性-1 082(A>G)位點與非洲西部的岡比亞[16]、馬拉維[17]人群肺結核易感性之間并無顯著關聯(lián)。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)IL-10-1 082(A>G)位點A基因型與意大利西西里島人肺結核易感性顯著相關[18]；在柬埔寨人群中進行的另一項關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)其GA雜合型攜帶者患肺結核風險較野生純合型個體顯著升高[19]；而IL-10-592(C>A)位點的C基因型與韓國人群肺結核患病風險降低相關[20]。此外，基于單體型的分析顯示，IL-10基因1 082(A>G)、819(C>T)、592(C>A)三位點能夠形成GCC、ACC、ATA三種主要單體型，在與加納人群結核菌素皮膚試驗反應的相關性研究中關聯(lián)顯著，但與肺結核易感性的關聯(lián)并無統(tǒng)計學意義[21]；在我國香港進行的一項研究則表明單體型-GCC與肺結核患者復發(fā)呈輕度相關[22]。

然而，細胞因子基因多態(tài)位點的等位基因頻率隨著地域、人種的不同呈現(xiàn)出顯著的差異，這在一定程度上決定了其與肺結核易感性相關性的不同。本研究結果表明，IL-10基因-819(C>T)CC、CT、TT三種基因型在病例組中所占比例分別為34.0%、51.7%和14.3%，在對照組中所占比例分別為35%、52.4%和12.6%，在兩組間無顯著差異(P=0.901)。-1 082(A>G)AA、AG、GG三種基因型在病例組中所占比例分別為48.6%、43.2%和8.2%，而在對照組中分別為60.5%、36.1%和3.4%，病例組中的突變率顯著高于對照組，基因型分布頻率顯示兩組之間存在顯著差異(P=0.032)。按等位基因比較發(fā)現(xiàn)，A到G的突變能夠使個體肺結核的發(fā)病風險上調55%(P=0.012,OR=1.55，95%CI1.10～2.19)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)IL-10基因-1 082(A>G)位點單核苷酸多態(tài)性與我國西部漢族人群患肺結核的風險升高顯著相關，表明其多態(tài)性有望作為該地區(qū)肺結核早期預警和診斷的候選分子標志物，為建立和完善我國西部地區(qū)肺結核易感因素的資料具有很重要的理論和臨床意義。

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(本文編輯：王亞南)

譚國超，徐春娟，馬紀龍，等. 我國西部漢族人IL-10基因多態(tài)性與肺結核易感性的相關性研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 9(1)： 56-59.

Association Analysis of IL-10 Gene Polymorphisms with Tuberculosis SusceptibilityTanGuochao1,XuChunjuan1,MaJilong1,BianJing1,WenYu1,LaiLiwei1,ZhangFangqi2,ChengJiajun2(1TheThirdHospitalofPLAShibaheBranch,Baoji721006,China,2DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the association of tuberculosis susceptibility with IL-10 gene polymorphisms and to provide reference for early warning of tuberculosis. Methods147 tuberculosis patients and 209 healthy individuals were enrolled. χ2 test, T test and HWE test were conducted to examine the study populations, then the association between gene polymorphisms and tuberculosis susceptibility was analyzed. ResultsSample balance test showed all of the cases in two groups were no statistical difference in sex(P=0.575) and age(P=0.840). Genotyping detection rate was 99.7%. Hardy Weinberg equilibrium detection showed the individual in control was conformed to the laws of genetics(P=0.137, 0.311). The genotype frequencies of IL-10_2 849 polymorphism between case and control were not statistically significant (P=0.901). While the difference of IL-10_1 082 polymorphism between case and control was identified (P=0.032). G is a risk alleles (OR=1.55, 95%CI 1.10-2.19). Conclusions-1 082 polymorphism of IL-10 gene is associated with tuberculosis susceptibility of northwest Han Chinese, which may be helpful for the early warning of tuberculosis.

【Key words】Tuberculosis;Interleukin-10;Single Nucleotide Polymorphism

(收稿日期：2015-04-08)

Corresponding author：Tan Guochao, Email: tgcbj147@163.com

中圖法分類號：R562

文獻標識碼：A

通訊作者：譚國超，Email: tgcbj147@163.com

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.01.013

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科2