孫媛媛， 鄧 超， 陳敬華*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

劑100 μL，37℃孵育5 min。之后加入37℃預(yù)溫的0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，記錄凝固時(shí)間。上述測定均于加入試劑的同時(shí)啟動(dòng)秒表，所有試劑使用前均經(jīng)37℃預(yù)溫5 min。

2.2.2 凝血酶原時(shí)間（PT）測定 按2.2.1方法收集血漿，取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預(yù)溫3 min后加入37℃預(yù)溫PT試劑200 μL，記錄凝固時(shí)間，即為PT值。

2.2.3 CH活性檢測（抗Xa與抗IIa活性測定） 采用發(fā)色底物分光光度法測定樣品抗Xa和抗IIa活性，其原理為肝素與抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）形成復(fù)合物，該復(fù)合物小于18個(gè)糖鏈可抑制與發(fā)色底S-2765的水解反應(yīng)；而大于18個(gè)糖鏈的復(fù)合物，可結(jié)合凝血酶即FIIa，從而抑制與發(fā)色底物S-2238產(chǎn)生水解反應(yīng)。未與AT-Heparin復(fù)合物結(jié)合的FXa和FIIa，會(huì)分別與發(fā)色底S-2765和S-2238發(fā)生反應(yīng)，釋放出一種具有顏色的物質(zhì)pNA，通過在405 nm下檢測pNA的濃度，即可計(jì)算出抗Xa、抗IIa因子活性。具體如下：

先制定肝素抗Xa與抗IIa活性的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：準(zhǔn)備配置0、0.25、0.5、0.75、1 IU/mL的肝素標(biāo)準(zhǔn)液，取標(biāo)準(zhǔn)液40 μL肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入40 μL抗凝血酶Ⅲ，振蕩混勻后，于37℃恒溫箱中反應(yīng)2 min，再加入40 μL發(fā)色底物，振蕩混勻后，37℃精確反應(yīng)2 min（抗IIa精確反應(yīng)1min），再加入80 μL檸檬酸終止液終止反應(yīng)。使用紫外分光光度儀測量肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液和CH樣品405 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算CH的抗Xa因子、抗IIa因子活性。

低相對分子質(zhì)量肝素接枝羧甲基纖維素超支化聚合物的合成、表征及活性研究

孫媛媛1， 鄧 超2， 陳敬華*1

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為提高低分子量肝素的生物活性，用末端接枝法將末端醛基低相對分子質(zhì)量肝素（LMWH-CHO）綴合在羧甲基纖維素 （CMC）主鏈上，形成一種強(qiáng)負(fù)電性的超支化聚合物（LMWH-grafted CMC，CH）。LMWH-CHO是通過亞硝酸鈉降解法制備獲得，利用EDC催化酰胺鍵生成反應(yīng)使CMC氨基化，然后通過醛基和氨基的希夫堿反應(yīng)將二者綴合。運(yùn)用傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯(lián)用技術(shù)（GPC-MALLS）等方法對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子量進(jìn)行表征，并對聚合物的抗凝血、抗血栓活性進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，在氨基化CMC糖單元與LMWH-CHO摩爾比為1∶5的條件下反應(yīng)12 h，得到接枝率為23.7%的CH超支化聚合物。該聚合物活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）為146 s，比LMWH延長了25%，凝血酶原時(shí)間（PT）為27.9 s，約為LMWH的2倍。此外，該聚合物抗Xa IC50值為104.2 nmol/L，比LMWH降低了近4倍；抗IIa IC50值為642 nmol/L，遠(yuǎn)低于LMWH（＞2 000 nmol/L）。表明，制備的CH超支化聚合物抗凝血和抗血栓活性均遠(yuǎn)優(yōu)于低相對分子質(zhì)量肝素。

低相對分子質(zhì)量肝素；超支化聚合物；表征；生物活性

肝素（Heparin）廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織中，如肝、腸粘膜、脾、肺、心等[1]。肝素作為抗凝血藥物已有80余年[2]，是最重要抗凝血和抗血栓的生化藥物之一[3]。肝素對心血管外科和血液透析的發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)，然而，在發(fā)揮其抗凝和抗栓作用的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生許多難以避免的副作用，如肝素多來源于豬、牛的小腸粘膜，存在潛在的病毒感染危險(xiǎn)[4]；劑量個(gè)體差異性大，導(dǎo)致合適劑量[5]和持續(xù)給藥時(shí)間難以確定[6]；并且容易出現(xiàn)因肝素引發(fā)的血小板減少癥[4，7]等。針對上述肝素使用過程中出現(xiàn)的問題，人們研制出了新型抗凝血藥物——低相對分子質(zhì)量肝素[8]（LMWH）。與傳統(tǒng)肝素相比，LMWH具有鏈短、結(jié)合部位少，生物利用度高，且半衰期長，個(gè)體差異和不確定因素少，劑量易于確定，無需進(jìn)行血藥濃度檢測等優(yōu)點(diǎn)[9]，LMWH具有較高的抗凝血活性，但抗血栓性能相比普通肝素卻大幅降低。因此，對LMWH進(jìn)行修飾以及通過酶法或化學(xué)法合成LMWH衍生物備受研究者們青睞。Chen等[10]采用不同酶組合的方法獲得了具有抗凝活性的硫酸乙酰肝素結(jié)構(gòu)，其抗凝活性不如普通肝素但是優(yōu)于LMWH。Oh等[4]以藥物Arixtra戊多糖還原端的兩個(gè)糖單元為單位合成了聚合度可控的LMWH類似物。該LMWH類似物均一性較好，但是合成步驟復(fù)雜，純化困難，應(yīng)用受到一定限制。

超支化聚合物是一類可以通過一步法來合成的具有高度支化結(jié)構(gòu)的體型大分子[11]。與相同質(zhì)量的線型聚合物相比，它有獨(dú)特的三維體型分子結(jié)構(gòu)，高度支化的分子鏈分布，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)賦予了它不同于線性聚合物的優(yōu)異性能，如溶解性能[12]及化學(xué)多功能性[13-14]等。超支化聚合物存在高分布密度的端基官能團(tuán)，增加了聚合物的端效應(yīng)[15]，賦予聚合物更高的生物性能[16]。Jeong等人[17]研究了星形聚環(huán)氧乙烷-聚乳酸嵌段聚合物，其具有良好的可吸水性和生物相容性，使得該聚合物成為很好的藥物緩釋材料。Frey等[12]以五氯苯酚甲基丙烯酸酯為骨鏈，通過酯化反應(yīng)成功合成了一種超支化聚甘油類似物用作藥物載體。

作者以羧甲基纖維素糖鏈作為核心，利用其糖單元上C-6位羧甲基與乙二胺發(fā)生酰胺化縮合反應(yīng)進(jìn)行氨基化修飾，再與用亞硝酸鈉降解法制備的末端醛基化的LMWH綴合，形成一類新的強(qiáng)負(fù)電性羧甲基纖維素-低相對分子質(zhì)量肝素（CH）超支化聚合物（圖1）。針對聚合物支鏈的空間位阻效應(yīng)及反應(yīng)體系中較低的聚合基元濃度，合成出長主鏈的超支化聚合物需要接枝側(cè)鏈大量過量，產(chǎn)物的分離純化困難的問題，采用NaCl多次超濾方法對產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及生物活性檢測。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

亞硝酸鈉、濃硫酸、碳酸氫銨：AR，購于中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肝素鈉，生化試劑：購于中國生工生物工程（上海）股份有限公司；氰基硼氫化鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC）、乙二胺（EDA）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：分析純，購于中國Sigma Aldrich公司；活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測定試劑盒（鞣花酸）、凝血酶原時(shí)間（PT）測定試劑盒（凍干型）：購于中國上海太陽生物技術(shù)有限公司；肝素抗Xa因子測定試劑盒、肝素抗IIa因子測定試劑盒：購于中國北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

FreeZone 2.5 L冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司產(chǎn)品；AUV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津儀器有限公司產(chǎn)品；VATAR-360傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；AduanceⅢ400MHz核磁共振分析儀：德國布魯克公司產(chǎn)品；FreeZone 2.5L冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司產(chǎn)品；GPCDAWN HELEOS型18角度激光光散射聯(lián)用系統(tǒng)：美國懷雅特技術(shù)公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CH超支化聚合物的制備

2.1.1 還原末端為醛基的低相對分子質(zhì)量肝素（LMWH-CHO）的制備 LMWH-CHO的制備方法參照Wan[18]的亞硝酸降解法。反應(yīng)得到的澄清溶液在0.1 mol/L NH4HCO3溶液中透析 （MWCO 3 500 Da），樣品經(jīng)凍干后混合溴化鉀壓片，在波長范圍為500~4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜（FTIR）表征。

采用GPC-MALLS技術(shù)對肝素降解前后的相對分子質(zhì)量及分布進(jìn)行測定。溶劑與流動(dòng)相：0.2 mol/ L NaCl（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%NaN3），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。Wyatt-OPTILAB rEx示差檢測器和GPC色譜柱柱溫均為25℃；流量：0.5 mL/min；定量環(huán)：100 μL；分別準(zhǔn)確稱取肝素標(biāo)準(zhǔn)品及LMWH-CHO樣品4 mg，用2 mL流動(dòng)相溶解，過夜放置，樣品溶液經(jīng)孔徑為0.22 μm濾膜過濾后注入GPC-MALLS測試系統(tǒng)進(jìn)行測量。

2.1.2 氨基化羧甲基纖維素鈉（CMC-NH2）的合成取200 mg（0.76 mmol）CMC粉末溶于50 mL去離子水中，加入218.67 mg EDC（1.14 mmol）和87.45 mg NHS（0.76 mmol），調(diào)節(jié)體系pH至5.0，反應(yīng)1 h以活化羧基，隨后逐滴滴入50 μL乙二胺（EDA），將pH調(diào)至7.4左右，25℃攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物用截留相對分子質(zhì)量為25 000的透析袋在去離子水中透析，冷凍干燥后得到CMC-NH2，樣品用1H NMR確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

2.1.3 CH產(chǎn)物合成及其分離與純化 CH超支化聚合物的合成是通過Schiff堿親核加成反應(yīng)制備。取64 mg（0.2 mmol糖單元）CMC-NH2溶于40 mL去離子水中，與40 mL含有700 mg（0.1 mmol）LMWH-CHO的水溶液充分混勻，之后加入63 mg（0.1 mmol）氰基硼氫化鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下65℃油浴中攪拌反應(yīng)12 h。將反應(yīng)后的溶液在去離子水中透析（MWCO 1 400 Da），冷凍干燥得到CH超支化聚合物。

稱取適量樣品用0.2 mol/L的NaCl溶液溶解，用超濾管（MWCO 100 kDa）連續(xù)超濾多次，并不斷加NaCl溶液稀釋樣品溶液，用GPC-MALLS對樣品純度進(jìn)行檢測，當(dāng)出現(xiàn)均一的LS-RI檢測峰時(shí)可視為純化好的樣品，并用1H-NMR和紫外可吸收光譜（UV-vis）對其產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)。

2.1.4 CH中LMWH接枝率測定 稱取10 mg肝素標(biāo)準(zhǔn)品溶于pH為7.4的PBS溶液中，定容至1 L，配置成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的肝素鈉母液，分別取0.50、1、1.5、2、2.5、3 mL母液稀釋至10 mL配成質(zhì)量濃度分別為 0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的肝素鈉PBS標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)液和0.005%甲苯胺藍(lán)溶液（0.005%）各2.5 mL，加入到10 mL玻璃管中，充分混勻后于37℃恒溫箱中反應(yīng)2 h。取出后加入4.5 mL正己烷，劇烈震蕩，使之充分萃取。以甲苯胺藍(lán)-PBS溶液為空白，于405 nm處檢測各濃度肝素相對應(yīng)的吸光度值（Y），以肝素濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制肝素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出樣品中LMWH的濃度。

2.2 CH生物活性檢測

2.2.1 活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測定 人靜脈采血1.8 mL于5 mL含0.2 Ml3.2%枸櫞酸鈉的抗凝試管中，反復(fù)顛倒3~4次，3 000 r/min離心15 min，收集上層黃色血漿。取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預(yù)溫5 min后加入APTT試

劑100 μL，37℃孵育5 min。之后加入37℃預(yù)溫的0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，記錄凝固時(shí)間。上述測定均于加入試劑的同時(shí)啟動(dòng)秒表，所有試劑使用前均經(jīng)37℃預(yù)溫5 min。

2.2.2 凝血酶原時(shí)間（PT）測定 按2.2.1方法收集血漿，取樣品10 μL和待測血漿90 μL震蕩混勻，37℃預(yù)溫3 min后加入37℃預(yù)溫PT試劑200 μL，記錄凝固時(shí)間，即為PT值。

2.2.3 CH活性檢測（抗Xa與抗IIa活性測定） 采用發(fā)色底物分光光度法測定樣品抗Xa和抗IIa活性，其原理為肝素與抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）形成復(fù)合物，該復(fù)合物小于18個(gè)糖鏈可抑制與發(fā)色底S-2765的水解反應(yīng)；而大于18個(gè)糖鏈的復(fù)合物，可結(jié)合凝血酶即FIIa，從而抑制與發(fā)色底物S-2238產(chǎn)生水解反應(yīng)。未與AT-Heparin復(fù)合物結(jié)合的FXa和FIIa，會(huì)分別與發(fā)色底S-2765和S-2238發(fā)生反應(yīng)，釋放出一種具有顏色的物質(zhì)pNA，通過在405 nm下檢測pNA的濃度，即可計(jì)算出抗Xa、抗IIa因子活性。具體如下：

先制定肝素抗Xa與抗IIa活性的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：準(zhǔn)備配置0、0.25、0.5、0.75、1 IU/mL的肝素標(biāo)準(zhǔn)液，取標(biāo)準(zhǔn)液40 μL肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入40 μL抗凝血酶Ⅲ，振蕩混勻后，于37℃恒溫箱中反應(yīng)2 min，再加入40 μL發(fā)色底物，振蕩混勻后，37℃精確反應(yīng)2 min（抗IIa精確反應(yīng)1min），再加入80 μL檸檬酸終止液終止反應(yīng)。使用紫外分光光度儀測量肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液和CH樣品405 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算CH的抗Xa因子、抗IIa因子活性。

3 結(jié)果與討論

3.1LMWH-CHO的表征

利用傅里葉變換紅外光譜表征亞硝酸鈉降解前后肝素官能團(tuán)的變化。如圖2所示，經(jīng)亞硝酸降解后的肝素在1 740 cm-1位置新出現(xiàn)了醛基的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，說明肝素末端成功被醛基化。在2 919 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是烷基的CH伸縮振動(dòng)吸收峰；3 431 cm-1處出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰是羥基的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 620 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是羧基的C=O非對稱伸縮振動(dòng)。醛基化前后糖鏈的主要結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變。

如圖3所示，與肝素標(biāo)準(zhǔn)品相比，降解得到的LMWH-CHO相對分子質(zhì)量分散性較好，洗脫體積后延，肝素的重均相對分子質(zhì)量（MW）為2.009×104g/mol，降解后MW降為7.007×103（表1）。在EDC催化下，CMC上羧甲基與EDA上氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，得到CMC-NH2。LMWH-CHO與CMC-NH2通過Schiff堿綴合，經(jīng)氰基硼氫化鈉還原后得到CH聚合物。與未經(jīng)修飾的CMC對比，CMCNH2的1H-NMR波譜（圖4）在2.91×10-6處出現(xiàn)了EDA亞甲基氫。根據(jù)其峰面積與理論上均未修飾時(shí)CMC C-6位羧甲基上亞甲基氫峰面積的比值計(jì)算，糖環(huán)上46.7%的羧甲基成功被氨基化修飾。

3.2 CH聚合物的分離與純化

產(chǎn)物透析、凍干處理后經(jīng)GPC-MALLS檢測，如圖5（a）所示，樣品的示差信號顯示為非均一峰，樣品中含有兩種不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)，且小分子物質(zhì)占總量的85%。這可能是由于反應(yīng)過程LMWH-CHO大量過量，未反應(yīng)的LMWH-CHO以非共價(jià)結(jié)合方式纏繞在CMC鏈上。經(jīng)多次加鹽解離超濾，大分子物質(zhì)比例逐漸提高，超濾10次后，兩種物質(zhì)的示差峰已明顯分離開（圖5（b）），此時(shí)大分子物質(zhì)占52%。超濾15次后，大分子物質(zhì)達(dá)到總量的90%（圖5（c）），繼續(xù)超濾，得到示差信號均一的大分子聚合物（圖5（d））。

3.3 CH結(jié)構(gòu)表征

樣品的紫外可見光譜圖見圖6，與肝素標(biāo)準(zhǔn)品相比，LMWH-CHO在波長250 nm左右有很強(qiáng)的吸光值，此處為醛基不飽和鍵的紫外吸收特征峰。通過LMWH-CHO上的醛基與CMC上的氨基形成希夫堿結(jié)構(gòu)綴合后，醛基特征峰消失，證明CH中沒有未反應(yīng)的LMWH-CHO殘留。

CH聚合物的成功合成還可從1H-NMR波譜（圖7）證明，由于肝素具有很強(qiáng)的不均一性，且CMC和LMWH-CHO糖鏈上H在3×10-6~4×10-6處有多處重合，用NMR分析整個(gè)CH樣品結(jié)構(gòu)非常困難。但是CH樣品的1H-NMR波譜中明顯既有肝素的特征峰也有CMC的特征峰，2.91×10-6（b）為CMC-NH2上乙二胺亞甲基氫，3.51×10-6（d）為CMC C-5位氫，2.05×10-6為肝素酰胺上的氫 （a），4.5× 10-6~5.5×10-6為肝素糖鏈H的特征峰（f，g）。

3.4 CH中肝素結(jié)合量測定

根據(jù)測試結(jié)果繪制肝素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 （圖8），經(jīng)線性回歸后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.755 14-15x，R2=0.999 1，說明方程擬合較好，根據(jù)該方程，計(jì)算出CH中LMWH-CHO含量為23.7%。

3.5 CH活性測定

APTT和PT檢測結(jié)果顯示（表2），形成CH超支化聚合物后APTT和PT均明顯比LMWH長。LMWH在人血漿中質(zhì)量濃度為150 μg/mL時(shí)，CH聚合物的APTT和PT值分別為146 s、27.9 s，APTT比相同條件的LMWH延長了24.8%；PT比LMWH延長了近2倍。

表2中IC50是指樣品對FXa和FIIa的半抑制濃度，即活性為50%時(shí)，所需要的樣品濃度（nmol/mL）。IC50值越大說明在抑制相同程度的FXa和FIIa時(shí)，所用的樣品濃度越大，其抗凝血和抗血栓能力就越弱。從表2中可以看出，LMWH FXa IC50值最大，為514.21 nmol/L，形成超支化聚合物后，樣品IC50值為104.2 nmol/L，比LMWH降低了4.9倍。上述結(jié)果說明CH超支化聚合物的抗凝血活性較LMWH有顯著提高。CH超支化聚合物對FIIa也有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為642 nmol/L，說明該聚合物有較好的抗血栓作用，而LMWH沒有明顯的抗血栓作用。

4 結(jié)語

以CMC為骨鏈，以LMWH-CHO為支鏈，采用末端接枝的方法成功將LMWH-CHO綴合在CMC鏈上。在CMC-NH2和LMWH-CHO摩爾比為1∶5的條件下反應(yīng)12 h，可得到LMWH-CHO接枝率為23.7%CH超支化聚合物。1H-NMR譜和紫外可見吸收光譜證明了該CH超支化聚合物的分子結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)相符；研究結(jié)果表明，通過這種方法制備的超支化LMWH衍生物活性盡管不及普通肝素，但遠(yuǎn)優(yōu)于LMWH。該方法具有制備過程簡單，一步即可完成聚合反應(yīng)，純化操作簡便可行。

[1]李涵，崔慧斐.肝素在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2014（1）：109-114. LI Han，CUI Huifei.Application of heparin in cancer therapy[J].Chemistry of Life，2014，34（1）：109-114.（in Chinese）

[2]WU M Y，HSU Y H，BAI C H，et al.Regional citrate versus heparin anticoagulation for continuous renal replacement therapy：a meta-analysis of randomized controlled trials[J].American Journal of Kidney Diseases，2012，59（6）：810-818.

[3]RAN F，NIE S，LI J，et al.Heparin-like macromolecules for the modification of anticoagulant biomaterials[J].Macromolecular Bioscience，2012，12（1）：116-125.

[4]OH Y I，SHENG G J，CHANG S K，et al.Tailored glycopolymers as anticoagulant heparin mimetics[J].Angewandte Chemie，2013，125（45）：12012-12015.

[5]PAN J，QIAN Y，ZHOU X，et al.Oversulfated chondroitin sulfate is not the sole contaminant in heparin [J].Nature Biotechnology，2010，28（3）：203-207.

[6]HIRSH J，WARKENTIN T E，RASCHKE R，et al.Heparin and low-molecular-weight heparin：mechanisms of action，pharmacokinetics，dosing considerations，monitoring，efficacy，and safety[J].CHEST，1998，114：489S-510S.

[7]張苗，劉文，陳荊曉，等.還原響應(yīng)型K5多糖膠束藥物載體的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，34（1）：34-39. ZHANG Miao，LIU Wen，CHEN Jingxiao，et al.Preparation and properties of the redox-sensitive K5 polysaccharide micelles as drug carrier[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（1）：34-39.（in Chinese）

[8]PUYMIRAT E，AISSAOUI N，COLLET J P，et al.Comparison of bleeding complications and one-year survival of low molecular weight heparin versus unfractioned heparin for acute myocardial infarction in elderly patients.The FAST-MI registry[J]. International Journal of Cardiology，2013，166（1）：106-110.

[9]RHODES S，BOND S.A review of the practical advantages of low molecular weight heparin in the treatment of cancer-related venous thromboembolism[J].Eur J Oncol Nurs，2008，12（5）：425-429.

[10]CHEN J H，JONES C L，LIU J.Using an enzymatic combinatorial approach to identify anticoagulant heparan sulfate structures[J]. Chemistry&Biology，2007，14（9）：986-993.

[11]鄧珊珊，王明超，曹琦琛，等.超支化聚合物新材料富集糖肽方法的研究[J].中國生物工程雜志，2014（8）：67-73. DENG Shanshan，WANG Mingchao，CAO Qichen，et al.Glycopeptides extraction using hyperpolymer-assisted hydrazide functionalized microsparticles[J].China Biotechnology，2014，34（8）：67-73.（in Chinese）

[12]Schüll C，Nuhn L，Mangold C，et al.Linear-hyperbranched graft-copolymers via grafting-to strategy based on hyperbranched dendron analogues and reactive ester polymers[J].Macromolecules，2012，45（15）：5901-5910.

[13]Jikei M，Kakimoto MA.Hyperbranched polymers：a promising new class of materials[J].Progress in Polymer Science，2001，26（8）：1233-1285.

[14]KIM Y H，WEBSTER O W.Water soluble hyperbranched polyphenylene："a unimolecular micelle?"[J].Journal of the American Chemical Society，1990，112（11）：4592-4593.

[15]司甲清.聚合物分子刷的制備及表征[D].湘潭：湘潭大學(xué)，2011.

[16]易建建.超支化聚酰亞胺的制備和表征以及性能的研究[D].北京：北京化工大學(xué)，2010.

[17]JEONG B，CHOI Y K，BAE Y H，et al.New biodegradable polymers for injectable drug delivery systems[J].Journal of Controlled Release，1999，62（1-2）：109-114.

[18]萬菁，陳敬華.肝素修飾金納米粒子的制備及表征[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（8）：1521-1524. WAN Jing，CHEN Jinghua.Preparation and characterization of heparin-modified gold nanoparticles[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2009，13（8）：1521-1524.（in Chinese）

Synthesis，Characterization and Biological Activity of a LMWH Hyperbranched Carboxymethylcellulose Polymer

SUN Yuanyuan1， DENG Chao2， CHEN Jinghua*1
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A strongly negative hyperbranched copolymer （LMWH-grafted CMC，CH）was synthesized by low-molecular-weight heparin （LMWH）grafted onto carboxymethylcellulose（CMC）backbone to improve the biological activities of LMWH via multivalent effect.LMWH with an aldehyde group at their reduce ends（LMWH-CHO）was prepared from heparin degradation by nitrous acid.The amide bond was formed between the amino group of EDA and the carboxylic groups of CMC when catalyzed by EDC and the primary amino groups were introduced to the backbone（CMC-NH2）.LMWH-CHO was thus grafted onto CMC-NH2by the Schiff-base reaction.The synthesized hyperbranched polymer was characterized by FTIR，NMR and GPC-MALLS to detect its chemical structure and molecular weight.Furthermore，the anticoagulation activities of the polymer were determined.The results showed that the grafted ratio of CMC was 23.7%with a molar ratio of CMC-NH2to LMWH-CHO of 1∶5.The APTT and PT of the polymer were 146 s and 27.9 s，respectively，which were 1.25-fold and 2-fold higher compared with that of LMWH.In addition，the IC50value of anti-factor Xa and anti-factor IIa of the polymer were 104.2 nmol/L and 642 nmol/L，respectively.The values were much lower than those of LMWH.In conclusion，LMWH grafted CMC polymer possessed a better anticoagulation activity than LMWH.

low-molecular-weight heaparin，hyperbranched polymer，characterization，biological activity

Q 538；R 944.9

A

1673—1689（2016）11—1182—07

2015-02-05

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20110093110008）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃基金項(xiàng)目（NCET-10-0435）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和生物功能材料研究。E-mail：jhchenwhut@126.com