李欣南，關(guān)一夫（.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽006；2.中國醫(yī)科大學生物與微生物教研室，遼寧沈陽000）

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摻假肉檢驗技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

李欣南1，關(guān)一夫2，*
（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.中國醫(yī)科大學生物與微生物教研室，遼寧沈陽110001）

摘要：綜述近年來摻假肉的類別。闡述摻假肉現(xiàn)狀的產(chǎn)生原因。收集、整理現(xiàn)有摻假肉鑒別檢測技術(shù)研究進展及現(xiàn)狀。剖析摻假肉檢測技術(shù)發(fā)展趨勢，為相關(guān)檢測技術(shù)研發(fā)人員提供技術(shù)參考和思路。

關(guān)鍵詞：摻假肉；鑒別；檢測技術(shù)

一部以中國美食為主題的大型紀錄片《舌尖上的中國》在各大媒體相繼播出后，掀起了飲食行業(yè)的軒然大波，人們?yōu)槊朗扯駸帷槊朗车膫鞒卸鴵鷳n、為美食的精湛而驚羨。然而，潛伏的食品安全問題卻不容忽視，“三聚氰胺”、“地溝油”、“瘦肉精”等有毒有害物質(zhì)危害著人們的健康。

在眾多的食品安全事件中，最值得長期、持續(xù)關(guān)注的應(yīng)該是摻假肉問題。其原因主要有3個方面：（1）中國的畜禽肉品的消費市場龐大。60年來我國年人均肉類消費量增長了近13倍，肉類消費經(jīng)歷了由追求量的滿足轉(zhuǎn)向提高質(zhì)量的發(fā)展軌跡，目前正處于穩(wěn)步發(fā)展階段[1]。2013年據(jù)有關(guān)的機構(gòu)和專家測算，綜合考慮各種因素，我國未來10年，肉類產(chǎn)品平均增長速度從需求量來看不會低于5 %[2]。（2）中國畜禽養(yǎng)殖量龐大、交易市場分布零散，監(jiān)管盲點較多。以肉牛交易市場為例，有關(guān)資料統(tǒng)計，全國肉牛交易市場大約3 000余個，全國平均10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)一個肉牛交易市場，這些交易市場中以小型市場為主?？陀^地講，這些交易市場多為非專業(yè)化交易場所，不規(guī)范，市場管理水平低下，交易方式落后，存在很多監(jiān)管上的漏洞，為不法分子的不法行為提供了可乘之機。（3）肉類尤其是牛肉、羊肉、驢肉等高價肉品摻假利潤豐厚。隨著飼養(yǎng)成本的增加，牛肉、羊肉等肉品市價價格逐年攀升，其中牛肉和羊肉的市價分別由2011年的36元/kg和40元/kg上升到2013年的70元/kg和80元/kg。其間的獲利空間非常大，因此，不法分子為謀取暴利，不擇手段，在牛肉、羊肉等肉品中摻雜廉價肉品形式多樣。摻假肉主要集中在注水、注膠肉；牛、羊肉中摻雜鴨肉或豬肉；牛、羊肉與狗肉等肉類食品中摻雜植物源性蛋白；再有，肉制品中摻雜狐貍?cè)?、貉子肉等?jīng)濟動物肉等形式也很常見，已成食品行業(yè)的一大隱患。例如英國和愛爾蘭2013年1月中旬的“馬肉風波”，2013年2月江蘇無錫制售假羊肉[3-4]以及2013年12月底的濟南沃爾瑪驢肉中摻雜狐貍?cè)馐录?。綜上，摻假肉已成為我國重要的食品安全事件。因此，我們必須堅守科技陣營、提高現(xiàn)代摻假肉鑒別水平，為加強食品安全監(jiān)管提供堅實有力的技術(shù)支撐。

傳統(tǒng)對肉品質(zhì)的鑒別方法主要是依賴于感官判斷和形態(tài)學檢驗[5]。但感官判斷和形態(tài)學檢驗的局限性較大，尤其不適用于肉類來源鑒別和加工產(chǎn)品的鑒別。國外對肉類摻假檢驗方法的研究起步較早，基本確立了以特征性的脂肪、蛋白質(zhì)、核酸作為靶標物進行肉類摻假檢驗的基本思路[6]。當前主要分析手段有紅外光譜分析、色譜分析、核磁共振法、質(zhì)譜分析、免疫分析和DNA分析，這些現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用大幅提高了檢驗方法精度和準確度。本文綜述了當前常見摻假肉的類型和檢測方法，并探討了不同檢測方法的適用性和優(yōu)缺點，為建立符合市場需求的檢測標準提供參考和借鑒。

1　摻假肉檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

1.1注水肉

注水肉是指在屠宰前一定時間給動物灌水，或者屠宰后向肉內(nèi)注水制成。注水肉會降低肉類的品質(zhì)，容易造成病原微生物和病菌病毒的污染，同會加速肉類產(chǎn)品變質(zhì)腐敗的速度，從而給人們的健康造成嚴重的危害。各種肉類的自然（基準）含水量，可以用國標法事先測定（標定）出來，按照國家規(guī)定的畜禽肉水分限量標準GB18394-2001《畜禽肉水分限量》規(guī)定豬肉、牛肉、雞肉的含水量＞77 %，羊肉含水量＞78 %，既可判為注水肉，或含水量超標。注水肉的檢測技術(shù)主要有顯微鑒別法鏡、刀切法鑒別、紙片法、壓力損失法、滴水損失法、蒸煮損失法、冰凍法[7]。

1.1.1干燥箱干燥法

將樣品與砂和乙醇充分混合，混合物在水浴上預(yù)干，然后再（103±2）℃溫度下烘干至恒重，測其質(zhì)量損失。該法為GB/T9695.15-2008《肉與肉制品水分含量測定》所在第二法，亦為GB18394-2001《畜禽肉水分限量》的仲裁法。

1.1.2蒸餾法

樣品中加入新蒸餾的甲苯，連接冷凝管與水分接受管，將樣品中的水分與甲苯共同蒸餾，收集餾出液于接受管內(nèi)，根據(jù)餾出液體積計算含量。該法由于甲苯毒性較大、且操作復(fù)雜、耗時長不適宜大量樣品檢測。

1.1.3紅外線干燥法（快速法）

用紅外線加熱將水分從樣品中去除，再將干燥前后的質(zhì)量差計算成水分含量。市售紅外線快速水分分析儀，就是利用該原理設(shè)計改造的，水分測定范圍0 %～100 %，讀數(shù)精度0.01 %。

1.1.4蒸煮損失法

采取待檢精肉0.5 kg置于鍋中加水2 L煮沸1 h，取出肉塊放涼稱重用熟肉重量除以鮮肉重量求得熟肉率正常的熟肉率大于50 %，而注水肉的熟肉率低于50 %[8]。

1.1.5微電容法測量

電容傳感器的電容量取決于介質(zhì)的檢點常數(shù)，注水的肉介電常數(shù)要比沒有注水的肉高，因此，由于介電常數(shù)的差異使得所測電容不同，從而達到對肉含水量檢測的目的?，F(xiàn)在市面上很多注水肉檢測儀都是依據(jù)微電容法設(shè)計研發(fā)的，其準確率較高，便于現(xiàn)場操作檢測。

1.2注膠肉

“注膠肉”是用食用膠和水的混合液注入牛羊體內(nèi)，然后利用膠的凝固性將水分“鎖”住。有的屠宰戶在注膠的同時，還加入一些食鹽和防腐劑，以延長肉的保質(zhì)期。一頭250 kg的牛可注入40 kg～50 kg的“膠水”，而一頭100 kg的豬也可注入15 kg～35 kg。隨著注膠肉越來越多的出現(xiàn)在市場上，一些不法商販將卡拉膠、血水及一些工業(yè)原料注入肉里，使注膠肉比注水肉更難識別，危害極大。注膠肉檢測方法尚無國家標準出臺，其檢測方法主要靠感官識別，而近紅外光譜技術(shù)和低場核磁共振技術(shù)的應(yīng)用也為注膠肉的檢測提供了新的檢測思路。

1.2.1注膠肉的近紅外光譜快速判別分析

楊紅菊等[9]采用近紅外透射光譜法，用一階導(dǎo)數(shù)對光譜進行預(yù)處理，采用因子化法建立的定性判別模型能很好的對注膠肉和正常肉進行判別，模型的正確判別率為100 %。該研究結(jié)果表明采用近紅外透射光譜和判別分析法相結(jié)合為注膠肉的快速判別分析提供了一種快速有效的篩選方法。

1.2.1基于低場核磁共振技術(shù)的注膠肉快速檢測

低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)在研究很多與水分密切相關(guān)的食品性質(zhì)上具有特殊的優(yōu)勢，利用氫原子核在磁場中的活動特性，可以追蹤待測物質(zhì)（食品）中的氫原子特別是水，包括結(jié)合水、不易流動水和自由水，觀察水分分布狀況及其隨著時間的變化而產(chǎn)生的改變[10]，能夠獲得生物材料中不同狀態(tài)水分及其各自的相對含量等信息，且樣品無需經(jīng)過任何預(yù)處理，樣品需要量少，快速無損[11]。肌肉中的水分以結(jié)合水、不易流動水和自由水3種形式存在[12]。研究表明，LF-NMR橫向弛豫時間（T2值）的差異可有效區(qū)分肉品中水分的3種分布狀態(tài)：T2b=1 ms～10 ms反映和大分子緊密相連的水，可認為其對應(yīng)結(jié)合水[13]；T21=30 ms～60 ms反應(yīng)位于高度組織化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的水或細胞內(nèi)水，可認為其對應(yīng)不易流動水[14]；T22=100 ms～400 ms為肌原纖維蛋白外部的水或細胞外水，對應(yīng)于自由水[15]。人工強行注入肌肉中水分多以自由水存在，如混以淀粉、膠類物質(zhì)則類似不易流動水，均可通過測定T2值及對應(yīng)峰值而識別。龐之列等[16]基于LF-NMR技術(shù)，利用t21、A21、P21、L*這4項指標，建立了豬肉含水量的檢測方法，可檢測出不同含水量的豬肉。吳藝影等[10]利用低場核磁共振技術(shù)結(jié)合PCA法，不僅可以區(qū)分正常肉與注膠肉，還能區(qū)分不同種類膠、以及同種膠不同質(zhì)量分數(shù)和注射膠水后不同時間的豬肉。LF-NMR技術(shù)作為新型檢測技術(shù)，在注水肉和注膠肉的檢測鑒別上發(fā)揮了重要作用，同時，也給摻假肉研究人員提供了新的研發(fā)思路。

1.3肉種摻假

肉種摻假由來已久，是零售市場和肉品加工業(yè)中普遍存在的問題。主要是指以低價格的雞肉、鴨肉或其他病死動物肉類冒充高價牛、羊等肉類。如在牛羊肉中摻雜鴨肉、雞肉并加入調(diào)味劑和色素制造出的牛、羊“肉卷、肉串”。皮毛動物肉冒充牛、羊肉等，如狐貍?cè)?、貉子肉、貂肉等摻雜冒充驢、牛、羊肉。摻雜肉制造者手段高明，一般感官檢驗很難分辨，因此，需要能夠準確鑒別肉品種屬的方法對其進行確證檢驗。目前，摻雜肉鑒別方法主要有紅外光譜分析法、色譜法、質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法和PCR法。

1.3.1紅外光譜分析

紅外光譜可用于有機物的檢測，當紅外光譜儀中發(fā)出的紅外光線，照射到待測物表面后，有機物能產(chǎn)生吸收特性，對發(fā)射的紅外光進行吸收，然后產(chǎn)生出一個紅外光譜圖[17]。肉類中含有豐富的蛋白質(zhì)、有機酸、碳水化合物等，運用紅外光譜法可以對肉中的有機物成分進行定性、定量分析[18]。近年來，中紅外光譜和近紅外光譜技術(shù)在肉類摻假檢測方面都取得了諸多進展，在不同物種之間的鑒別主要用于鑒別豬肉、羊肉、牛肉、雞肉等不同物種以及摻假肉，鑒別正確率在90 %以上[19]。如Osama等[20]用中紅外光譜檢測摻有牛腎臟或肝臟的碎牛肉，根據(jù)脂肪和瘦肉組織中蛋白質(zhì)、脂肪、水分含量的不同對肉類產(chǎn)品加以辨別，能鑒別出摻假牛肉，識別出含10 %～100 %肝臟或腎臟的牛肉產(chǎn)品。Cozzolino等[21]對牛肉、羊肉、雞肉和豬肉的混合樣品進行了近紅外光譜的鑒別分析，采用偏最小二乘方（PLS）回歸，通過建立測量光譜與樣品含量之間的校正模型對樣品種源進行定性驗證，發(fā)現(xiàn)其判別正確率超過80 %。紅外光譜技術(shù)可實現(xiàn)肉種摻假的快速、無損檢測，但由于物質(zhì)在近紅外區(qū)吸收弱、靈敏度低，且建模工作難度大，因此，在實際應(yīng)用中限于作為初步篩選的方法使用。

1.3.2色譜和質(zhì)譜分析

肉中的一些蛋白質(zhì)、肽類和氨基酸組成因物種來源的不同而存在差異，通過色譜定量、定性分析也能反映肉種摻假情況。Chung等[22]通過與物種相關(guān)的組氨酸二肽，利用反相柱高效液相色譜法可檢出肉及肉制品種類。Giaretta等[23]采用高效液相色譜法（HPLC）檢測豬肉和牛肉中的肌紅蛋白，以特征組分的色譜峰面積變化識別牛肉中摻入豬肉成分的含量。Christoph von Bargen等[24]利用HPLC-MS/MS技術(shù)和胰蛋白酶肽的特異性標記，建立了一種檢測深加工樣品中的馬肉和豬肉的方法，可檢出牛肉基質(zhì)中0.24 %的豬肉或馬肉添加，方法分離效率高、靈敏度高。盡管色譜和質(zhì)譜分析具有高效、準確等優(yōu)勢，但需要大型儀器設(shè)備且分析成本昂貴，對操作人員技術(shù)水平要求較高，目前應(yīng)用范圍很小。

1.3.3酶聯(lián)免疫分析

酶聯(lián)免疫檢測分析技術(shù)，是通過抗體特異性識別肉制品中物種特征性蛋白的方式檢測動物源性成分，早在上個世紀90年代ELISA技術(shù)就已經(jīng)開始應(yīng)用于肉類的物種鑒別[25-26]，可實現(xiàn)肉種摻假的定性和定量檢測。ELISA技術(shù)主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法、直接競爭法、間接競爭法等幾種類型[27]。常用于肉種摻假檢測的ELISA方法是間接法和雙抗體夾心法。目前ELISA方法的建立主要是利用抗體對肌肉和血清蛋白或熱穩(wěn)定性蛋白來鑒別不同種類的動物肉類。例如Rencova等[28]利用不同的熱穩(wěn)定蛋白作抗原免疫兔，以多克隆抗體建立了敏感性較好的間接競爭ELISA方法，成功鑒別了熱加工的家禽、馬、袋鼠和老鼠的肌肉組織。酶聯(lián)免疫檢測方法具有很高的特異性和靈敏度，操作簡單、分析容量大、安全可靠、儀器成本較低，是當前肉類種屬快速篩選的首選方法。

1.3.4DNA分析

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)，可根據(jù)不同物種的基因保守序列的特異性進行種屬的鑒別。相對于蛋白標志物而言，DNA分子具有優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性，不受肉制品熱加工的限制。Bartlet[29]利用法醫(yī)核苷酸序列信息的方法，首次建立了鑒定肉制品動物源性的PCR方法。KarabasanavarNS等[30]對豬線粒體D-Loop環(huán)的基因序列設(shè)計特異性引物，建立豬肉的PCR鑒別方法，檢測靈敏度為0.1 %。PCR-RFLP與單重PCR過程類似，但擴增后需要進行限制性內(nèi)切酶酶解，生成特定的酶切片段，通過有無特定長度的DNA片段就可以確定樣品種類。高琳等[31]針對動物線粒體細胞色素b基因建立了PCR-RFLP方法，可從6種生肉及7種加工肉制品中鑒別出豬源性和牛源性成分，所有樣品經(jīng)PCR擴增均產(chǎn)生359 bp的片段，擴增子采用Alu限制性酶切，所產(chǎn)生的片段差異可用于區(qū)分豬肉和牛肉。同普通PCR方法相比多重PCR可以實現(xiàn)同時檢測多種肉種的目的，且檢測成本低，適于基層檢測的需求。何瑋玲等[32]從動物線粒體細胞色素b基因，篩選出一組特異性多重PCR引物，建立了豬肉、牛肉、羊肉和雞肉的通用引物多重PCR快速鑒別方法。

PCR法操作簡便可實現(xiàn)定性檢驗和高通量篩選，但卻不能進行定量分析，實時熒光定量PCR檢測法（Real-time PCR）的開發(fā)和使用彌補了這一缺憾。實時熒光PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，最后通過觀察熒光信號來對未知模板進行定性、定量分析的方法。凌睿等[33]基于SYBR Green溶解曲線和Myostatin通用引物建立了一種新的快速、簡便且成本低的肉類摻假鑒別的方法，可避免假陰性檢測結(jié)果出現(xiàn)。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP）是由日本學者Notomi等[34]發(fā)展起來的一種新型基因檢測專利技術(shù)，目前已經(jīng)開發(fā)出基于LAMP法檢測肉制品動物源性成分的方法，并取得了很好的效果。Amir Abdulmawjood[35]等人基于線粒體細胞色素b基因建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法檢測鴕鳥肉成分，該LAMP方法是結(jié)合使用實時熒光，肉制品中鴕鳥肉檢測限可達0.01%，檢測時間可在15min～20min內(nèi)完成，該LAMP方法具有良好的特異性和敏感性。楊麗霞等[36]針對豬肉線粒體DNA COXⅠ基因設(shè)計LMAP引物，通過擴增產(chǎn)物電泳和重點染色法鑒定反應(yīng)，并采用熒光檢測儀實施監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)果表明該LAMP方法能有效、特異地檢測出牛羊肉中的豬肉成分。

2　展望

隨著造假水平的提高，僅依靠視覺、味覺難以準確判斷肉制品的真?zhèn)?。而目前適用范圍廣、準確度高的DNA檢測方法又存在檢測成本過高的問題，很難為消費者所普及，不能嚴格打擊假冒偽劣現(xiàn)象。對于肉制品尤其是冷鮮肉的摻假檢驗更急需一些快速、準確的篩查方法，這種快速檢測方法和產(chǎn)品的開發(fā)與研究將是科技工作者的重點研究方向。據(jù)報道[37]，一種可在10min內(nèi)辨別肉類是否摻假的“肉類快速鑒別儀”已研發(fā)成功并通過鑒定。這種肉類快速鑒別儀，利用動物肌肉組織及骨髓中一種特殊蛋白隨加熱溫度顯現(xiàn)的變性程度差異，以及與試劑會發(fā)生顯色反應(yīng)，進行生肉種類鑒別的快速檢測，填補了肉類摻假快速鑒別的空白。盡管該項技術(shù)還未被推廣應(yīng)用，但它卻體現(xiàn)了當前摻假肉檢測技術(shù)發(fā)展的方向，快速檢測技術(shù)和產(chǎn)品將成為該領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。此外，基因芯片[38-40]技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，也將為建立快速摻假肉檢測方法開辟新的路徑。

目前應(yīng)用最廣的快速檢測方法諸如NIRS和ELISA均是借鑒了其他專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)轉(zhuǎn)化而來，因此，廣大研究人員應(yīng)打破專業(yè)界限，在交叉學科中尋求其他相關(guān)領(lǐng)域方法的轉(zhuǎn)換，讓摻假肉鑒別技術(shù)迅速、成熟的發(fā)展起來，為廣大消費者及執(zhí)法部門提供安全、快速、有效的檢測手段。

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Present Situation of Testing Technology of Meat Adulteration

LI Xin-nan1，GUAN Yi-fu2，*
（1.Quality and Safety Testing Center for Veterinary Drugs，Animal Feed and Animal Products in Liaoning Province，Shenyang 110016，Liaoning，China；2.Key Laboratory of Medical Cell Biology，Ministry of Education，Department of Biochemistry and Molecular Biology，China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning，China）

Abstract：Review category adulterated meat in recent years.Expounds the causes of adulterated meat status.Collecting and sorting out the progress and present situation of the existing detection techniques to identify adulterated meat.Analysis of the development trend of meat adulteration detection technology，to provide technical reference and ideas for the correlation detection technology research and development personnel.

Key words：adulterated meat；identification；detection technology

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.044

基金項目：遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃（2015202013）

作者簡介：李欣南（1978—），女（漢），博士在讀，研究方向：分子檢測技術(shù)、細菌耐藥性安全評價。

*通信作者：關(guān)一夫（1955—），男（滿），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物分子檢測技術(shù)以及臨床應(yīng)用、腫瘤生物學。

收稿日期：2014-10-20