劉子鑫，石潔，李楠，郭衛(wèi)星，程凱，孫居仙，劉善榮，程樹(shù)群

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

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循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)性肝癌診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)展

劉子鑫，石潔，李楠，郭衛(wèi)星，程凱，孫居仙，劉善榮，程樹(shù)群

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶脫落，進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前臨床常用的外周血CTCs的分離和檢測(cè)方法主要有聯(lián)合磁珠分離CD45+(CTCs檢出率50%)、ISET方法(CTCs檢出率50%)、密度梯度離心、EpCAM聯(lián)合CD45磁珠分離法(CTCs檢出率53.9%～92.9%)、體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)(CTCs檢出率60.7%)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色(CTCs檢出率30.5%)等。CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價(jià)值，且CTCs計(jì)數(shù)與PLC多灶性、門(mén)靜脈癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分級(jí)密切相關(guān)。外周血CTCs數(shù)與PLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，CTCs計(jì)數(shù)越多，患者預(yù)后越差。治療前后外周血CTCs數(shù)量變化可評(píng)價(jià)PLC的治療效果。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；原發(fā)性肝癌；臨床應(yīng)用

原發(fā)性肝癌(PLC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率居常見(jiàn)惡性腫瘤病死率的第3位[1]。PLC起病隱匿，發(fā)展迅速，惡性程度高，早期臨床表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛和惡心、食欲減退、腹脹、腹瀉等消化道癥狀；且PLC細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，病情早期即可侵犯血管、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此早診斷、早治療對(duì)于PLC患者的預(yù)后具有重要意義[3]。目前臨床認(rèn)為的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)除了包括自發(fā)自腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞外，還包括在診療操作中造成的腫瘤細(xì)胞脫落而進(jìn)入血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞[4]。由于其來(lái)源的特殊性，在腫瘤患者外周血中檢測(cè)到的CTCs可能從某種程度上反應(yīng)患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特性，從而為臨床監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、腫瘤的個(gè)體化治療、判定腫瘤患者的預(yù)后提供依據(jù)[5]。本文就CTCs在PLC診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1　外周血CTCs的分離和檢測(cè)方法

理想的分離檢測(cè)CTCs的平臺(tái)具有以下幾個(gè)特征[6]：①能檢測(cè)能夠檢測(cè)到每一個(gè)癌癥患者樣品血中的每個(gè)CTCs,同時(shí)在健康對(duì)照的樣品中沒(méi)有假陽(yáng)性的出現(xiàn)；②高純度,分離的CTCs不能混雜其他正常細(xì)胞；③能夠保持分離得到的CTCs的活性、形態(tài)正常、蛋白核酸穩(wěn)定，以便開(kāi)展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床特性的獲得；④廉價(jià)、高產(chǎn)出、快捷，以便臨床推廣；⑤結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)。到目前為止，相比于乳腺癌和結(jié)腸癌，僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)PLC中CTCs的檢測(cè)和定量方法進(jìn)行了研究[7～16]。Stott等[7,8]采用流式分選后裸鼠皮下種植的方法，CTCs檢出率30%；有學(xué)者[9，10]采用聯(lián)合磁珠分離CD45+細(xì)胞的方法分離CTCs，CTCs檢出率高達(dá)53%；Guo等[11，12]采用ISET方法分離檢測(cè)了44例患者的外周血CTCs，檢出率為52.3%；Xu等[13]采用密度梯度離心、EpCAM、CD45磁珠分離等方法，CTCs檢出率53.9%～92.9%；Liu等[14]采用體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌患者外周血CTCs的動(dòng)態(tài)變化，與傳統(tǒng)流式敏感性相比提高1.8倍；有學(xué)者[15,16]分別采用cellsaerch系統(tǒng)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色檢測(cè)肝癌患者外周血CTCs，CTCs檢出率分別為66.7%、30.5%。這些研究采取的研究材料均不同，有直接采用患者抽靜脈血，有應(yīng)用細(xì)胞系或小鼠動(dòng)物模型；同時(shí)，受限于工藝差別以及各自不同的研究背景，這些報(bào)道所采用的CTC富集和檢測(cè)的方法不一樣，得到的結(jié)果也各有差異。

2　CTCs在PLC診斷中的應(yīng)用

CTCs直接來(lái)源于腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶，其計(jì)數(shù)和分子特征的鑒定可在一定程度上反映腫瘤的特性，因此，CTCs可以作為一種新興的腫瘤標(biāo)記物來(lái)對(duì)腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及治療反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于其檢測(cè)對(duì)象為外周血，無(wú)需通過(guò)有創(chuàng)手段來(lái)對(duì)實(shí)體腫瘤進(jìn)行取材就可以進(jìn)行病理學(xué)檢查，這種檢測(cè)方式被稱(chēng)作是“液態(tài)活檢”[17]。Yang等[12]運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD45-CD90+細(xì)胞在肝癌患者血液樣品中的分布情況,CTC檢出率高達(dá)90%，而在對(duì)照肝硬化患者、健康體檢者的血液中均未檢出CTC。說(shuō)明CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價(jià)值，當(dāng)腫瘤原發(fā)灶不能被傳統(tǒng)的檢測(cè)手段檢測(cè)到時(shí)，可以通過(guò)外周血檢測(cè)CTCs來(lái)提前預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生，為PLC的早期介入治療提供依據(jù)，提高PLC的治療效果。

3　CTCs在PLC預(yù)后評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

既往研究認(rèn)為，腫瘤患者外周血中出現(xiàn)CTCs，預(yù)示著預(yù)后不良，且CTCs計(jì)數(shù)更是與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[18]。Liu等[14,16]研究發(fā)現(xiàn)，用cell-search系統(tǒng)檢測(cè)的肝癌患者外周血CTCs數(shù)與肝預(yù)后密切相關(guān)，提示術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、患者生存率低。Vona等[10]研究發(fā)現(xiàn)外周血CTCs≥4個(gè)的肝癌患者生存期明顯短于外周血未見(jiàn)CTCs者。Schulze等[16]也利用cell-search系統(tǒng)檢測(cè)59例HCC患者外周血中EpCAM+細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)CTC計(jì)數(shù)與HCC患者的總體生存期、BCLC分期、血管侵犯和肝癌特異性標(biāo)記物AFP強(qiáng)相關(guān)。

4　CTCs在PLC療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

大量研究已經(jīng)證實(shí)，在肝癌切除或者肝移植前就有CTC進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，他們可能逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷而在患者體內(nèi)潛伏，它們以休眠的狀態(tài)隱匿于患者體內(nèi)，在某些因素的激發(fā)下，它們可以被激活而重新增殖，并遷移到靶器官，從而導(dǎo)致肝外轉(zhuǎn)移或者肝內(nèi)復(fù)發(fā)，這也被廣泛認(rèn)為是轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要一步[14,18]。并且這一現(xiàn)象或許增加肝癌切除或肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，從而顯著降低術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存率。為提高肝臟移植術(shù)后的無(wú)病生存期，Toso等[19]調(diào)整免疫狀態(tài)，以通過(guò)免疫介導(dǎo)清除CTCs，達(dá)到降低CTCs的數(shù)量。當(dāng)病灶不能被現(xiàn)有的檢測(cè)手段檢測(cè)到時(shí)，我們沒(méi)有一個(gè)可靠的指標(biāo)和靶點(diǎn)來(lái)指導(dǎo)這一階段的治療，這樣可能錯(cuò)過(guò)了一個(gè)癌癥治療的關(guān)鍵的有效時(shí)期。而由于CTCs的特殊來(lái)源，即使是很小的病灶(<1 mm)或者在腫瘤尚未在體內(nèi)形成原發(fā)灶時(shí)，我們就可以在血液中查到腫瘤細(xì)胞，因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能作為一個(gè)指導(dǎo)此時(shí)期臨床治療的指標(biāo)或者其本身可以作為治療的靶點(diǎn)。有研究已經(jīng)證實(shí)，治療前后CTCs的數(shù)量上的變化可以反映腫瘤對(duì)治療的敏感性以及增殖活性[20,21]。

CTCs作為一種腫瘤標(biāo)記物出現(xiàn)，由于其特殊的來(lái)源，可以作為潛在的臨床應(yīng)用指標(biāo)，近幾年對(duì)其研究出現(xiàn)高潮[22]。同時(shí)，也由于其自身的特性使其在臨床推廣中也遇到困難。首先，由于腫瘤的“上皮-內(nèi)皮轉(zhuǎn)變”(EMT)現(xiàn)象，CTCs的異質(zhì)性較高，從而缺少一個(gè)高度特異的生物標(biāo)記[23]。其次，除了由于其高異質(zhì)性和缺少特異性標(biāo)記外，其數(shù)目相對(duì)較少也使得分離和檢測(cè)技術(shù)更加困難。每106～107個(gè)單核細(xì)胞中才有一個(gè)CTC，這使得其分離更加困難，準(zhǔn)確性也不容易保證[24]。

綜上所述，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶脫落，進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前臨床常用的外周血CTCs的分離和檢測(cè)方法主要有聯(lián)合磁珠分離CD45+(CTCs檢出率50%)、ISET方法(CTCs檢出率50%)、密度梯度離心、EpCAM聯(lián)合CD45磁珠分離法(CTCs檢出率53.9%～92.9%)、體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)(CTCs檢出率60.7%)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色(CTCs檢出率30.5%)等。CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價(jià)值，且CTCs計(jì)數(shù)與PLC多灶性、門(mén)靜脈癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分級(jí)密切相關(guān)。外周血CTCs數(shù)與PLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，CTCs計(jì)數(shù)越多，患者預(yù)后越差。治療前后外周血CTCs數(shù)量變化可評(píng)價(jià)PLC的治療效果。盡管目前CTCs的臨床應(yīng)用尚未普及，隨材料學(xué)和組織學(xué)的發(fā)展、CTCs分離技術(shù)不斷提高，CTCs在PLC診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)中具有廣闊應(yīng)用前景。

[1] Dhanasekaran R,Limaye A,Cabrera R.Hepatocellular carcinoma: current trends in worldwide epidemiology,risk factors,diagnosis,and therapeutics[J].Hepatic Med Evide Res,2012,31(4): 19.

[2] Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death[J].Aust Med J,1869,14(3):146-149.

[3] Lianidou ES,Strati A,Markou A.Circulating tumor cells as promising novel biomarkers in solid cancers [J].Cri Rev Clini Lab Sci,2014,51(3):160-171.

[4] Hong B,Zu Y.Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends[J].Theranostics,2013,3(6):377.

[5] Lianidou ES,Mavroudis D,Georgoulias V.Clinical challenges in the molecular characterization of circulating tumour cells in breast cancer[J].British J Cancer,2013,108(12):2426-2432.

[6] Rodríguez-Perálvarez M,Luong TV,Andreana L,et al.A systematic review of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma: diagnostic and prognostic variability[J].Annals Surg Oncolo,2013,20(1):325-339.

[7] Stott SL,Lee RJ,Nagrath S,et al.Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer[J].Science Trans Med,2010,2(25):23-25.

[8] Attard G,de Bono JS.Utilizing circulating tumor cells: challenges and pitfalls[J].Curr Opin Genet Dev,2011,21(1):50-58.

[9] Waguri N,Suda T,Nomoto M,et al.Sensitive and specific detection of circulating cancer cells in patients with hepatocellular carcinoma;detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA after immunomagnetic separation[J].Clin Can Res,2003,9(8):3004-3011.

[10] Vona G,Estepa L,Béroud C,et al.Impact of cytomorphological detection of circulating tumor cells in patients with liver cancer[J].Hepatology,2004,39(3):792-797.

[11] Guo J,Yao F,Lou Y,et al.Detecting carcinoma cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma by immunomagnetic beads and rt-PCR [J].J Clin Gas,2007,41:783-788.

[12] Yang ZF,Ngai P,Ho DW,et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer[J].Hepatology,2008,47(3):919-928.

[13] Xu W,Cao L,Chen L,et al.Isolation of circulating tumor cells in patients with hepatocellular carcinoma using a novel cell separation strategy [J].Clin Cancer Res,2011,17:3783-3793.

[14] Liu S,Li N,Yu X,et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells[J].Gastroenterology,2013,144(5):1031-1041.

[15] Schulze K,Gasch C,Staufer K,et al.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer,2013,13(3):2165-2171.

[16] Schulze K,Beneken C,Staufer K,et al.Detection of Epcam-Positive Circulating Tumor Cells in Patients with Hepatocellular Carcinoma-a Pilot Study [J].Hepatology,2011,54(19):1357.

[17] Alix-Panabières C,Pantel K.Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer[J].Clinical Chem,2013,59(1):110-118.

[18] Chaffer CL,Weinberg RA.A perspective on cancer cell metastasis[J].Science,2011,331(6024):1559-1564.

[19] Toso C,Mentha G,Majno P,et al.Liver transplantation for hepatocellular carcinoma: five steps to prevent recurrence[J].Am J Transplant,2011,11(10):2031-2035.

[20] Huang JW,Liu B,Hu BS,et al.Clinical value of circulating tumor cells for the prognosis of postoperative transarterial chemoembolization therapy[J].Medical Oncology(Northwood,London,England),2014,31(9):175-175.

[21] Yamashita T,Budhu A,Forgues M,et al.Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-β-catenin signaling in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2007,67(22):10831-10839.

[22] Kim S R,Kudo M,Hino O,et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in Japan and Korea[J].Oncology,2008,75(Suppl 1):13-16.

[23] Yu M,Bardia A,Wittner BS,et al.Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition [J].Science,2013,33(9):580-584

[24] Riethdorf S,Pantel K.Advancing personalized cancer therapy by detection and characterization of circulating carcinoma cells [J].Ann N Y Acad Sci,2010,12(10):66-77.

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