張斌善，熊小娟，付　園，湯虎春

(漢中市林業(yè)工作中心，陜西 漢中)

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鑒定松材線蟲病的形態(tài)學(xué)方法

張斌善，熊小娟，付園，湯虎春

(漢中市林業(yè)工作中心，陜西 漢中)

摘要：介紹了松樹毀滅性病害——松材線蟲病預(yù)防監(jiān)測過程中取樣、分離、鏡鑒等環(huán)節(jié)的技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：松材線蟲?。蝗?；分離；鏡鑒

松材線蟲病是由松材線蟲寄生在松樹體內(nèi)所引起的一種毀滅性病害,被國家列為頭號檢疫對象。松褐天牛是其主要媒介昆蟲，具有較強自然擴散能力。疫木及其制品隨交通工具傳播是造成其大范圍擴散的根本原因。要防止松材線蟲病的擴散蔓延，實現(xiàn)第一時間發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年基本拔除疫點，必須做好預(yù)防工作。對松材及其制品的復(fù)檢和定期開展普查是做好預(yù)防工作的主要途徑。市、縣森防機構(gòu)是預(yù)防工作的前沿，經(jīng)常要對復(fù)檢、普查采集到的樣品進行鑒定。高等院校、科研機構(gòu)通常用采用成本很高的PCR進行鑒定，市、縣級森防機構(gòu)多不具備PCR鑒定條件，大多采用形態(tài)學(xué)方法，只要操作正確，注意細節(jié)，也會得到十分準確的結(jié)果。

1取樣

1.1松樹的取樣選擇

1.1.1死亡原因不明的枯死松樹在重點監(jiān)測區(qū)域，遇到死亡原因不明的枯死松樹，都應(yīng)采樣。死亡原因明確且并非由松材線蟲引起的死亡，無需取樣，如機械損傷、爛皮病誘發(fā)的次期害蟲危害、火災(zāi)、華山大小蠹等引起的死亡，不用取樣。

1.1.2死亡時間超過1 a、無論何種原因致死的松樹都會有大量腐生線蟲存在，盡可能選擇剛枯死或尚未完全枯死的優(yōu)勢木(針葉呈黃綠或黃褐色，樹皮未脫落，材質(zhì)未腐朽)。對于枯死時間超過1 a的松樹，如果需要取樣,應(yīng)當(dāng)取心材，而不要取邊材。

1.2取樣部位

整株枯死的松樹，在樹干上(主側(cè)枝交界處)、中、下(胸高處)三個部位取樣。

1.3取樣方式

1.3.1塊狀取樣對可疑病樹，采取塊狀取樣方法，在取樣部位采集木質(zhì)部100～200 g，為避免鉆取木屑時溫度超過50℃、迅速殺死松材線蟲，不能采取手鉆鉆取取樣。復(fù)檢松材及其制品時，應(yīng)首先了解原產(chǎn)地，若來自情發(fā)生區(qū)，需盡可能塊狀取樣，為避免樣品少分離不出線蟲，樣品質(zhì)量應(yīng)大于200 g。

1.3.2手鉆取樣對于無法塊狀取樣，可用較大手鉆取樣，手鉆越小，取樣造成的線蟲死亡數(shù)量就越多。

1.4 標記

在樣品上及時貼上標簽(包括樣品編號、采集地點、貨物名稱、樹種、樹齡、采集時間等)。

2分離

對采集的樣品及時進行分離和鑒定，正確的分離方法是及時發(fā)現(xiàn)松材線蟲病疫情的重要環(huán)節(jié)之一。

2.1分離的原理

線蟲個體小、身體密度大于水，可穿過紗布、高級面巾紙，受重力作用會下沉，且具有向水性，遇水會從植物體或媒介昆蟲體內(nèi)游出。

2.2分離方法

采用漏斗法分離。首先把塊狀或段木樣品的心材加工成黃豆大小顆粒(手鉆所取樣品不必加工)，再用雙層紗布或高級面巾紙包好，置于漏斗內(nèi)，加滿清水進行分離，時間一般認為12 h。夏季氣溫高、線蟲活躍，分離需時較短，分離2 h后，就可以用手持放大鏡通過漏斗頸觀察是否有線蟲游出，如果觀察到線蟲數(shù)量較多，則4～8 h就可以用來鏡鑒；如果線蟲數(shù)量較少，可以分離12～24 h，也可將段木短時間浸水后，保濕培養(yǎng)2～3 d重新分離；冬季溫度較低、線蟲不夠活躍，分離需時24～48 h。如果線蟲數(shù)量較少，又不具備培養(yǎng)條件，可多采幾次樣，多次分離。

3鏡鑒

3.1取分離液

松開止水夾從漏斗下的膠皮管內(nèi)取分離液置于小燒杯內(nèi)，最好不要超過2 mL，分離液太多，線蟲密度變小，鏡下不易觀察。若線蟲密度過大，可加清水稀釋。

3.2做臨時玻片

用膠頭吸管從燒杯內(nèi)吸少量分離液，滴一滴于干凈的載玻片上，然后在10×4倍顯微鏡下觀察有無線蟲。如果沒有線蟲，基本可以排除松材線蟲病。如果線蟲較多，則應(yīng)在酒精燈上來回移動約6 s，把線蟲殺死，再加蓋蓋玻片。不能先蓋玻片，再殺死線蟲，原因是加蓋玻片后，蓋玻片下液體很少，加熱時瞬間就可以把線蟲組織熔化，無法進一步觀察。

3.3鏡鑒

先在10×4倍微鏡鏡下觀察，看到線蟲后，調(diào)到10×10倍微鏡鏡下，轉(zhuǎn)動微調(diào)旋鈕，到觀察清楚為止。10×10倍鏡下能清晰的看到口針、中食道球、雄性生殖器。如果沒有口針，說明是腐生線蟲。如果有口針、中食道球、雄性生殖器(弓形)，說明有可能是松材線蟲或擬松材線蟲，需進一步觀察。通常微鏡鏡下都能觀察到腐生線蟲、幼蟲(看不到生殖器)，少量成蟲。在10×10倍微鏡鏡下，看到的松材線蟲或擬松材線蟲雄成蟲尾部呈魚鉤狀，雌成蟲的蟲體接近直線，大約在尾部1/3至1/4(陰門處)略彎曲。

松材線蟲和擬松材線蟲雄成蟲在形態(tài)上幾乎完全相同，因此在做形態(tài)鑒定時重點觀察雌蟲。在10×10倍微鏡鏡下選擇雌成蟲，放在視野中間，再調(diào)到10×40倍下觀察。如果沒有陰門蓋，就可以排除松材線蟲，如果有陰門蓋，則是松材線蟲或擬松材線蟲。最后觀察線蟲的尾部。尾部和陰部有時在同一視野內(nèi)，也應(yīng)針對尾部用微調(diào)調(diào)整焦距，進行觀察，因為其尾部和陰部不在同一平面內(nèi)。擬松材線蟲都有尾突，且長度超過2 um，松材線蟲則短于2 um。實際操作過程中，這一特征很難把握。在松材線蟲雌性群體中，有很大一部分個體尾部呈指圓形，其尾突自然就小于2 um。在10×40倍鏡下看到有陰門蓋，并且尾部呈指圓形的雌成蟲,就可以確定為松材線蟲。為了避免爭議，對觀察結(jié)果要在顯微鏡下拍攝成圖片，存檔。是否為松材線蟲病，最終由國家公布的權(quán)威機構(gòu)確定。

Identification of Pine Wilt Disease through Morphological Method

ZHANG Bin-shan, XIONG Xiao-juan, FU Yuan, TANG Hu-chun

(HanzhongForestryWorkCenter,Hanzhong,Shaanxi723000)

Abstract:Pine wilt disease (Bursaphelenchus xylophilus) is serious damaging disease to pine trees. Identification of it through morphological method was described regarding sampling, separation and identification under microscope.

Key words:Bursaphelenchus xylophilus; sampling; separation; identification under microscope

中圖分類號:S763.3

文獻標識碼:A

文章編號:1001-2117(2016)02-0116-02

作者簡介：張斌善( 1962-)， 長期從事森林病蟲害防治。

收稿日期：2015-07-18