蘭艷素， 王愛東， 牛江秀（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041）

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廣豆根總黃酮的超聲提取工藝及抗氧化活性

蘭艷素， 王愛東， 牛江秀
（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041）

摘要：目的 以廣豆根為原料，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法研究其中總黃酮的超聲提取工藝，然后進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試。方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液料比為考察因素，進(jìn)行3因素5水平星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面分析法優(yōu)化廣豆根中總黃酮的提取工藝，DPPH法研究純化前后總黃酮的自由基清除能力。結(jié)果 最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間30 min，液料比20∶1（mL/g）。在此條件下，黃酮得率為12.71 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值相符。而且，純化前后的廣豆根總黃酮對(duì)DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除能力。結(jié)論 該工藝簡(jiǎn)單、可行，而且總黃酮提取物具有明顯的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：廣豆根；總黃酮；超聲提?。恍屈c(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；抗氧化活性

廣豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根莖，是清熱解毒、利咽消腫的傳統(tǒng)中藥［1］，臨床上經(jīng)常用于治療咽喉炎、心律失常和黃疸等病癥［2］，含有黃酮、生物堿、三萜、甾醇［3］以及微量元素［4］等成分，前期已對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，結(jié)果首次從中分離得到10個(gè)已知黃酮類化合物［5］以及1個(gè)新黃酮類化合物［6］。據(jù)報(bào)道，很多藥材中均含有黃酮類化合物，是常見的藥效成分之一，具有很多的藥理活性，如抗病毒、抗氧化等，還可有效改善血管的滲透性［7］。因此，從廣豆根中提取總黃酮具有很好的應(yīng)用前景。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是一種能將數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)方法融于一體的新型試驗(yàn)方法，既能克服正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)精度不夠、操作繁瑣等缺陷，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)性較好［8］，故常被應(yīng)用于中藥有效成分（黃酮、生物堿、皂苷、三萜類等）的提取工藝、處方優(yōu)化等領(lǐng)域［9-10］。本實(shí)驗(yàn)采用超聲法輔助提取，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化廣豆根中總黃酮的提取工藝，并探討其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料 廣豆根采自安徽嶺南自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院方建新老師鑒定為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根莖。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)10080-200707，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；DPPH· （1，1-二苯基苦基苯肼，美國(guó)）。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器 UV-2600紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-300VDV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG-165臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 廣豆根中總黃酮提取工藝流程 廣豆根→60℃烘干→粉碎→80%乙醇浸泡0.5 h→超聲波提取→冷卻→離心15 min→總黃酮提取物。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取12.3 mg蘆丁對(duì)照品，烘箱中干燥12 h，完全溶解后定容于50 mL量瓶中，即得蘆丁對(duì)照品溶液。參考文獻(xiàn)［11］中的紫外分光光度法，并略做改動(dòng)。移取不同體積的蘆丁對(duì)照品溶液，依次加入NaNO2、A1（NO3）3和NaOH溶液進(jìn)行顯色，空白溶液調(diào)零，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A＝10.107χ＋0.045 9，R2＝0.999 5，表明線性關(guān)系達(dá)到試驗(yàn)要求。

1.3.3 廣豆根總黃酮的提取及含量測(cè)定 稱取1.0 g干燥的廣豆根粉末，轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，接上冷凝回流裝置，浸泡0.5 h，超聲（300 W、45 Hz）輔助提取一定時(shí)間。樣品溶液經(jīng)過冷卻、離心后，移取上層清液7 mL，適當(dāng)稀釋，然后按“1.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色操作，最后紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮含有量，從而得到其提取率，公式如下。

其中，C為稀釋后溶液的黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；M為樣品質(zhì)量（g）；V為離心后的上層溶液體積（mL）；N為稀釋的倍數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn) 稱取干燥的廣豆根粗粉1.0 g，共19份，分別轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，依次以乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（mL/g，10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30、35、40 min）為因素，在50℃提取溫度下超聲（300 W、45 Hz）提取，提取液經(jīng)冷卻、離心、稀釋等處理后，按照“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定溶液吸光度值，考察以上3個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL，按照“1.3”項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)定溶液吸光度值。結(jié)果，ISD為0.95%（n＝5），表明儀器精密度良好。

1.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取稀釋好的黃酮溶液5.0 mL，顯色后每隔20 min測(cè)定一次溶液的吸光度值。結(jié)果，ISD 為1.16%（n＝9），表明樣品溶液在3 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性較好。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取廣豆根粗粉1.0 g，在優(yōu)化后的提取工藝條件下提取，提取液按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮的含有量，平行5次。結(jié)果，ISD為0.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取5份在最優(yōu)提取工藝條件下的提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為0.635 5 mg/mL），分別加入等體積蘆丁溶液，依次加樣后顯色，測(cè)定溶液吸光度。結(jié)果，平均回收率為98.86%，ISD為1.08%，表明該方法回收率良好。

1.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率為300 W，頻率為45 Hz，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比為考察因素，總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素分別用X1、X2、X3表示，結(jié)果見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.7 廣豆根總黃酮的抗氧化活性測(cè)定 精密稱取冷藏避光存放的DPPH·固體19.9 mg，迅速用80%乙醇溶解，定容于250 mL棕色量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.2 mo1/L的DPPH·溶液，避光冷藏保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～80%之間時(shí)，總黃酮提取率的變化非常明顯，可能是因?yàn)樵擃惓煞执蠖酁橹?、低極性；在80%時(shí)，總黃酮提取率最高，可達(dá)14.82 mg/g；在40%時(shí)，提取率最低，只有12.95 mg/g，最大值與最小值相差較大，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響相對(duì)較大。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，當(dāng)提取時(shí)間為10 min時(shí)，總黃酮得率最低，為12.74 mg/g；隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，得率緩慢增加；在30 min以后，曲線變平緩，而且稍有下調(diào)，可能是因?yàn)樘崛〉臅r(shí)間過長(zhǎng)會(huì)對(duì)黃酮成分的結(jié)構(gòu)造成一定破壞。因此，確定提取時(shí)間為30 min。

2.1.3 液料比對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖3。

圖3 液料比對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，液料比在10∶1到15∶1（mL/g）之間的曲線較陡峭，總黃酮得率變化明顯，說明加大溶劑量可較好地促進(jìn)總黃酮的溶出；若液料比繼續(xù)擴(kuò)大，總黃酮量變化甚微，曲線不再上揚(yáng)；當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，提取率最高。因此，確定液料比為20∶1（mL/g）。

2.2 設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果 見表2。

2.2.1 模型擬合 采用Design Expert軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到超聲提取廣豆根總黃酮的回歸方程為Y＝12.75 -0.323 8X1＋0.070 6X2-0.254 6X3＋0.152 5X1X2-0.16X1X3＋0.342 5X2X3-0.800 4X21-0.347 8X22-0.561 7X23。然后，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表可知，X1和X3對(duì)總黃酮提取率的影響非常顯著；超聲提取時(shí)間的P值為0.115 1（＞0.05），說明提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響不顯著；X21、X22、X23的P值都小于0.000 1，影響都非常顯著。同時(shí)，液料比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響也很顯著，而其余交互作用也有一定影響。

另外，失擬項(xiàng)的P值為0.369 4（＞0.05），影響不顯著，說明試驗(yàn)所選的3個(gè)考察因素為主要影響因素，設(shè)計(jì)合理；所得模型的F值為82.96，P＜0.000 1，影響非常顯著。因此，該模型優(yōu)化得到的廣豆根總黃酮提取工藝條件可靠、準(zhǔn)確。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 效應(yīng)面分析 見圖4～6。

圖4可見，提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響的響應(yīng)曲面彎曲明顯，提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%處為曲線最高點(diǎn)。而且，曲線的左側(cè)較平緩，說明提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小。

圖5可見，當(dāng)提取時(shí)間固定，液料比在15∶1～25∶1 （mL/g）之間時(shí)，黃酮提取率緩慢增大，達(dá)到最高點(diǎn)后開始快速下降；當(dāng)液料比不變，延長(zhǎng)提取時(shí)間時(shí)，其變化不明顯，說明該因素對(duì)黃酮得率的影響不如液料比。由此可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)不變，液料比為20∶1（m L/g）的條件下提取30 min時(shí)，黃酮提取率最高。

圖6可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用曲面非常對(duì)稱，而且彎曲度明顯，可見其對(duì)廣豆根總黃酮提取率的影響較大。隨著液料比的上升以及乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，曲線先上揚(yáng)，后下調(diào)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，提取效果最好。

圖4 提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖5 提取時(shí)間與液料比交互影響黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互影響黃酮提取率的響應(yīng)面圖

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到具體實(shí)驗(yàn)操作的可行性，盡可能將模型工藝參數(shù)取整修正。稱取6份等質(zhì)量的廣豆根藥材，在功率為300 W，頻率為45 Hz，提取溶劑為80%乙醇，液料比為20∶1（mL/g）的條件下超聲提取30 min，提取液處理后分別進(jìn)行顯色，然后測(cè)定。結(jié)果，總黃酮的平均得率為12.71 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值相差不大，說明該模型可靠，可對(duì)廣豆根中總黃酮的提取結(jié)果進(jìn)行很好地預(yù)測(cè)。

2.4 抗氧化活性評(píng)價(jià) 按“1.7”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，分別考察不同質(zhì)量濃度（3.76～27.3 μg/mL）總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除作用，結(jié)果見圖7。

圖7 廣豆根總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

由圖可知，廣豆根粗提物對(duì)DPPH·具有一定的清除能力，其清除率曲線位于VC之下?？傮w來看，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的升高，清除能力也隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，廣豆根粗提物的線性方程為y＝2.716χ＋7.123 7 （R2＝0.986 1），IC50為15.79 μg/mL；VC的線性方程為y＝2.879 3χ＋19.434（R2＝0.942 7），IC50為10.62 μg/mL，可見總黃酮粗提液對(duì)DPPH·的清除能力稍弱于VC，當(dāng)前者質(zhì)量濃度大約為后者的1.49倍時(shí)，對(duì)DPPH·具有同等的抑制能力。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后，黃酮提取液的抗氧化活性得到了明顯增強(qiáng)，對(duì)DPPH·的清除率稍高于VC，表明安徽嶺南產(chǎn)的廣豆根具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

預(yù)試驗(yàn)分別采用乙醇回流法和超聲法提取廣豆根中總黃酮，并比較兩者的提取效果。結(jié)果表明，超聲提取技術(shù)可使總黃酮較好、較快地溶出，具有提取時(shí)間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，而且在提取溫度也不高，可盡量避免由于長(zhǎng)時(shí)間加熱或者高溫對(duì)有效成分結(jié)構(gòu)的破壞，故本實(shí)驗(yàn)選用超聲法進(jìn)行提取。另外，為了減小由于乙醇揮發(fā)所帶來的誤差，最好使用帶有冷凝回流的提取裝置。

而且，效應(yīng)面分析法所得模型的顯著性較高。在選取的3個(gè)考察因素中，影響最明顯的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次為液料比。最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間30 min，液料比20∶1（mL/g），該條件下總黃酮得率為12.71 mg/g，方法簡(jiǎn)便、可行。

然后，考察在最佳提取工藝條件下得到總黃酮提取物以及經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力。結(jié)果表明，安徽嶺南產(chǎn)的廣豆根藥材中總黃酮成分對(duì)自由基的清除率較高，抗氧化作用較好，研究開發(fā)前景可觀。

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作者簡(jiǎn)介：蘭艷素（1985—），女，碩士，助教，從事天然產(chǎn)物提取分離與活性研究。Te1：13685595775，E-mai1：1s7536858@163.com

基金項(xiàng)目：安徽高校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2013SQIL088ZD）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308085QH139）；黃山學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011xkj017）

收稿日期：2015-01-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.050

中圖分類號(hào)：I 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0698-05