張二鋒, 趙軍利, 楊 靜, 孫瑞潔, 韓 光(河南大學藥物研究所,河南開封475004)
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超濾法和HPLC法測定14-去氧穿心蓮內酯的血漿蛋白結合率
張二鋒, 趙軍利, 楊 靜, 孫瑞潔, 韓 光*
(河南大學藥物研究所,河南開封475004)
摘要:目的 測定14-去氧穿心蓮內酯在大鼠與人血漿中的蛋白結合率。方法 超濾法和HPLC法測定14-去氧穿心蓮內酯在大鼠與人血漿中的血漿蛋白結合率。結果 14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿中的平均血漿蛋白結合率分別為(93.88±2.16)和(95.55±0.83)%。結論 14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿蛋白均具有很強的結合能力,而且無明顯的濃度依賴性。
關鍵詞:14-去氧穿心蓮內酯;血漿蛋白;結合率;超濾;HPLC
穿心蓮為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分,《中國藥典》2010版一部記載,其性寒,味苦,歸心、肺、大腸、膀胱經,具有清熱解毒,涼血消腫功效[1],其有效成分為穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯等二萜內酯類化合物?,F代藥理研究表明,14-去氧穿心蓮內酯具有抗炎、抗癌、抗鉤端螺旋體病、治療酒精肝、抗菌等作用[2-10]。吳陽等[11]發(fā)現,脫水穿心蓮內酯與牛血清白蛋白、正常人血漿、大鼠血漿的血漿蛋白結合率分別為(71.50±1.50)%、(79.91±2.51)%、(82.41± 2.05)%,屬于中等強度的結合,但目前尚無關于14-去氧穿心蓮內酯與血漿蛋白結合率的研究報道。藥物血漿蛋白結合率可直接影響藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄,從而影響其作用強度與時間,是藥代動力學、分子藥理學等學科研究的重要課題之一[12]。本實驗采用超濾法和HPLC法測定14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結合率,為該成分的臨床合理應用與相關新藥研發(fā)提供可靠的依據。
1.1 儀器 島津LC-20AT HPLC色譜儀,包括CLASS-VP色譜工作站、紫外檢測器(日本島津公司);精密移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司);KQ-300VDE雙頻數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);NanosepI10KDa超濾管(美國Pa11公司);TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠);MaxiMix P1us漩渦混合器(美國Thermo Fisher Scientific公司)。
1.2 藥品與試劑 14-去氧穿心蓮內酯對照品(自制,結構經各波譜手段確認和HPLC法測定,按面積歸一化法計算,純度在99.5%以上);14-去氧穿心蓮內酯樣品(自制,純度在98.0%以上);肝素鈉(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司,批號1307132);正常人血漿(開封市中心血站)。乙腈為色譜純(天津市四友精細化學品有限公司);水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。
1.3 動物 SD大鼠,雄性,體質量(200±20)g(河南省實驗動物中心,合格證號SCXK[豫]2010-0002)。取健康SD大鼠5只,乙醚麻醉,75%酒精消毒,摘除眼球取血,置于肝素化的EP管中,4 000 r/min離心15 min,然后將上清液(血漿)轉移到另一EP管中,保存于4℃冰箱中,備用。
2.1 色譜條件 ST Pak C18-ES色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),包括預柱(50 mm×4.6 mm,北京迪馬科技有限公司);流動相為乙腈-水(40∶60);體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為205 nm;柱溫為室溫;進樣體積為20 μL。在該條件下,空白血漿中的內源物質不干擾主成分測定,專屬性較好,見圖1。
2.2 磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)的配制 取磷酸二氫鉀1.36 g,加入0.1 mo1/L氫氧化鈉溶液79 mL,蒸餾水稀釋至200 mL,即得。
2.3 對照品溶液的配制 精密稱取對照品10.02 mg,置于10 mL量瓶中,加入甲醇適量,超聲溶解,甲醇定容至10 mL,搖勻。精密吸取5 mL,置于25 mL量瓶中,PBS液定容,搖勻,即得。
2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取“2.3”項下對照品溶液0.005、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL,置于10 mL量瓶中,PBS液定容,搖勻,過0.22 μm濾膜,進樣20 μL。然后,以峰面積(A)對質量濃度(C)作回歸,得到標準曲線A=41 168C-6 218.2(r=0.999 9),表明在0.100 2~20.04 μg/mL范圍內線性關系良好。
2.5 精密度 分別精密配制質量濃度為4.008、10.02、20.04 μg/mL的14-去氧穿心蓮內酯溶液,PBS液定容,搖勻,過0.22 μm濾膜,進樣20 μL,測定峰面積ISD值。日內精密度分別在2、4、6、8、10 h進樣測定,而日間精密度分別在第1、2、3、4、5天進樣測定,結果見表1,表明儀器精密度良好。
表1 14-去氧穿心蓮內的精密度
圖1 超濾液的HPLC色譜圖
2.6 超濾膜回收率的考察 PBS液配制質量濃度分別為2.00、4.00、10.00 μg/mL的標準品溶液500 μL,置于超濾離心管超濾膜上,6 000 r/min離心30 min,取20 μL進樣測定,代入“2.4”項下標準曲線方程,計算回收率。結果,14-去氧穿心蓮內酯的回收率均大于93%,說明超濾膜對其沒有特異性吸附。
2.7 溫孵時間的考察 模擬人體體溫37℃的孵化時間,分別溫孵20、40、60、80、120、150 min。最終確定,溫孵120 min時,藥物與蛋白達到結合平衡狀態(tài)。
2.8 血漿蛋白結合率試驗 精密吸取標準品溶液30、50、100 μL,置于1.5 mL EP管中,分別加入大鼠與人血漿970、950、900 μL,渦旋1 min,37℃下恒溫水浴中溫孵2 h。然后,移取0.5 mL置于超濾管中,6 000 r/min離心30 min,取20 μL進樣測定,將峰面積代入標準曲線方程,計算14-去氧穿心蓮內酯的質量濃度,求出其血漿蛋白結合率,計算公式如下,結果見表2。
(ρ超濾前為超濾前14-去氧穿心蓮內酯的質量濃度,ρ超濾后為超濾后14-去氧穿心蓮內酯的質量濃度)
表2 14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結合率(±s,n=3)
表2 14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿的血漿蛋白結合率(±s,n=3)
質量濃度/ (μg·mL-1)大鼠血漿蛋白結合率/%人血漿蛋白結合率/% 6.012 91.20±4.03 93.87±1.33 10.02 94.30±1.39 95.77±0.43 20.04 96.14±1.06 97.02±0.73平均值93.88±2.16 95.55±0.83
由表可知,14-去氧穿心蓮內酯與大鼠和人血漿均具有很強的結合能力,并且在所考察的質量濃度范圍內,無明顯的濃度依賴性。
研究藥物血漿結合率的方法有超濾法、平衡透析法、超速離心法、凝膠過濾法等[12],其中較常用的為平衡透析法與超濾法,但前者耗時較長,可能引起藥物代謝降解,對藥物蛋白結合率的測定造成較大誤差,而后者不僅操作方便簡便,而且測定速度快,樣品用量少。因此,本實驗選擇超濾法[13]。
另外,本實驗考察了藥物模擬人體體溫37℃的孵化時間,發(fā)現藥物在溫孵120 min時,與蛋白達到結合平衡狀態(tài)。同時,還研究了超濾離心的轉速和時間,根據不漏蛋白,而且超濾液體積與超濾前總體積之比為0.3~0.6為宜的標準[14],最終確定離心時間為30 min,轉速為6 000 r/min。
實驗顯示,14-去氧穿心蓮內酯的平均蛋白結合率在93%以上,屬于高蛋白結合[15],表明如果在臨床上與其它藥物聯合使用,容易產生安全性問題。因此,有必要選擇臨床上聯合使用并具有高蛋白結合率的藥物,開展體外藥物蛋白競爭結合實驗,用于保證人體用藥的安全性。
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*通信作者:韓 光(1966—),女,博士,教授,碩士生導師,研究方向為天然活性成分研究及新藥開發(fā)。Te1:(0371)23880680,E-mai1:hang@henu.edu.cn
作者簡介:張二鋒(1988—),男,碩士,研究方向為天然活性成分研究及新藥開發(fā)。Te1:15136226020,E-mai1:779354666@qq.com
基金項目:國家自然科學基金項目(81373974);河南大學研究生教育綜合改革項目(Y1319023)
收稿日期:2015-01-27
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.047
中圖分類號:I969.1
文獻標志碼:B
文章編號:1001-1528(2016)03-0689-03