李 舒， 王淑美*， 楊洋博君， 劉啟歐（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室，重慶400016）

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益氣除痰方降低肺癌Caspase 6、Lam in B1表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制

李 舒1，2， 王淑美1，2*， 楊洋博君1，2， 劉啟歐1，2
（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室，重慶400016）

摘要：目的 研究益氣除痰方對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶6（Caspase 6）及核纖層蛋白B1（Lamin B1）表達(dá)的影響。方法 選用BALB/c裸小鼠40只，將肺癌A549細(xì)胞懸液接種于小鼠背側(cè)皮下建立肺癌模型，接種第7天將小鼠隨機(jī)分為5組，即模型組（生理鹽水組），順鉑注射液組（0.002 g/kg），益氣除痰方低、高劑量組（3.0、6.0 g/kg），聯(lián)合用藥組（3.0 g/kg益氣除痰方＋0.002 g/kg順鉑），每組8只。中藥灌胃，每天1次，連用21 d；順鉑注射液腹腔注射，每天1次，連用7 d。干預(yù)第22天，處死所有小鼠，測(cè)量瘤體質(zhì)量、體積，并采用免疫組化及IT-PCI法檢測(cè)腫瘤組織中Caspase 6、Lamin B1的表達(dá)。結(jié)果 益氣除痰方高劑量組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量明顯下降，免疫組織化學(xué)法及IT-PCI法檢測(cè)結(jié)果顯示，腫瘤組織中Caspase 6、Lamin B1的表達(dá)均降低，與模型組比較，差異有顯著性（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組與順鉑注射液組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論 益氣除痰方可抑制小鼠A549肺癌，與化療藥物聯(lián)用有一定的增效作用，其機(jī)制可能與通過降低Caspase 6、Lamin B1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：益氣除痰方；肺癌；Caspase 6；Lamin B1；細(xì)胞凋亡

肺癌的腫瘤細(xì)胞源于支氣管黏膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血液播散，患者診斷時(shí)多已至晚期，采用包括扶正抗癌的中藥在內(nèi)的綜合治療具有較好療效。中藥“益氣除痰方”是國(guó)家級(jí)重點(diǎn)?？茝V州中醫(yī)藥大學(xué)附一院腫瘤科臨床常用的治療肺癌的基本方，以益氣除痰、解毒散結(jié)為治療原則，本方長(zhǎng)期針對(duì)中晚期脾虛痰濕證肺癌患者運(yùn)用于臨床，具有顯著的療效。本實(shí)驗(yàn)研究益氣除痰方對(duì)肺癌移植瘤組織中Caspase 6、Lamin B1表達(dá)的影響，從半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑探討其抗癌機(jī)制［1］。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c裸小鼠40只，雌雄各半，鼠齡4～5周，體質(zhì)量16～18 g，獨(dú)立通風(fēng)籠系統(tǒng)（IVC），購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（渝）2012-0002。人肺癌細(xì)胞株A549由第三軍醫(yī)科大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)于美國(guó)HyC1one公司。順鉑注射液購(gòu)于齊魯制藥（海南）有限公司，批號(hào)H20073652。Caspase 6、Lamin B1抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，編號(hào)分別為bs-0084I、bs-1840I。SP免疫組化試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，編號(hào)為CW2053。PCI所用試劑焦碳酸二乙酯（DEPC）為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；TINzo1、PCI Mix Taq、溴乙錠為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；冰醋酸為重慶北碚精細(xì)化工廠產(chǎn)品；Tris堿為北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品；水乙醇為重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品；Iever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本Toyobo公司產(chǎn)品；瓊脂糖為日本Takara公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)選用的中藥，均根據(jù)《中國(guó)藥典》2000年版（一部）收錄品種，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院。按臨床“益氣除痰方”組成比例（人參15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、枳殼15 g、生半夏15 g、葶藶子15 g）稱量并粉碎，水煎2次，濃縮分裝，終質(zhì)量濃度為2.0 g/mL生藥，4℃保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

1.2 造模、分組、給藥 全部小鼠背側(cè)皮下各接種1×107個(gè)肺癌A549細(xì)胞，當(dāng)皮下腫瘤生長(zhǎng)至可明顯捫及時(shí)（接種第7天），將小鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水0.2 mL），順鉑注射液組（0.002 g/kg），益氣除痰方低、高劑量組（3.0、6.0 g/kg），聯(lián)合用藥組（3.0 g/kg益氣除痰方＋0.002 g/kg順鉑），每組8只。接種第7天，益氣除痰方低、高劑量組和聯(lián)合用藥組予中藥灌胃，每天1次，連用21 d。接種第21天，順鉑注射液組及聯(lián)合用藥組予順鉑注射液腹腔注射，每只0.2 mL，每天1次，連用7 d。接種第28天，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取出小鼠背側(cè)皮下的肺癌包塊，部分置于凍存管中放于超低溫冰箱保存，部分用10%多聚甲醛溶液固定。采用免疫組織化學(xué)法和IT-PCI法檢測(cè)腫瘤中Caspase 6、Lamin B1的表達(dá)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 腫瘤生長(zhǎng)抑制率 所有小鼠在干預(yù)完成后，經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后取出小鼠背側(cè)皮下的腫瘤包塊，稱取其瘤重，腫瘤生長(zhǎng)抑制率＝［（對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對(duì)照組瘤重］×100%。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤Caspase 6、Lamin B1的表達(dá) 按照免疫組織化學(xué)法（SP）試劑盒說明書步驟操作，Caspase 6、Lamin B1為一抗，檢測(cè)各組腫瘤組織中Caspase 6、Lamin B1的表達(dá)。其表達(dá)的定量分析為選取陽性細(xì)胞密集區(qū)域，在400倍顯微鏡下選取20個(gè)陽性細(xì)胞，用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro P1us 6.0測(cè)定平均吸光度值。

1.3.3 IT-PCI法檢測(cè)各組腫瘤caspase 6、lamin BI m INA的表達(dá) 取冷凍保存的組織，提取腫瘤組織中的總INA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCI反應(yīng)，用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity One 4.6.2分析圖像的灰度值，分別以caspase 6/Gapdh、lamin BI/Gapdh的灰度值比較代表m INA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，caspase 6

片段大小176 bp，正向引物序列為5＇-ATGCCGATTGCTTTGTGTGTGTC-3＇，反向引物序列為5＇-GTGCTGGTTTCCCCGACATG-3＇，lamin BI片段大小149 bp，上游引物序列為5＇-CCGGATGGTGGGGCTTTGTT-3＇，下游引物序列為5＇-CCGGGCCTCTCGATGGATAAGC-3＇。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠飲食、精神、活動(dòng)情況良好，治療組優(yōu)于模型組。實(shí)驗(yàn)小鼠接種肺癌A549細(xì)胞后成瘤率為100%，干預(yù)過程中存活率為100%。

2.2 各組腫瘤生長(zhǎng)情況比較 順鉑注射液組、益氣除痰方高劑量組、聯(lián)合用藥組的腫瘤體積和瘤重明顯下降，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組較順鉑注射液組明顯下降（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組抑瘤率為60.9%，較順鉑注射液組升高，有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

表1 組腫瘤生長(zhǎng)情況比較（±s，n＝8）

表1 組腫瘤生長(zhǎng)情況比較（±s，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與順鉑注射液組比較，▲P＜0.05

組別　　劑量/（g·kg-1）　　腫瘤體積/cm3　　瘤重/g　　抑瘤率/%模型組2.40±0.54　0.64±0.09　-順鉑注射液組　0.002　1.28±0.42*　0.36±0.07*　43.75益氣除痰方低劑量組　3.0　2.00±0.26▲　0.53±0.07*▲　17.19▲益氣除痰方高劑量組　6.0　1.58±0.28*　0.43±0.12*　32.81▲聯(lián)合用藥組　3.0＋0.002　0.64±0.24▲　0.25±0.09*▲　60.90-▲

2.3 免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤組織Caspase 6、Lamin B1的表達(dá) Caspase 6主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Lamin B1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，陽性表達(dá)均呈棕黃色。順鉑注射液組、益氣除痰方高劑量組、聯(lián)合用藥組的Caspase 6、 Lamin B1平均光密度值較模型組升高，有顯著性差異（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組較順鉑注射液組升高，有顯著性差異（P＜0.01），見圖1、圖2、表2。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤組織Caspase 6的表達(dá)（SP，×400）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤組織Lam in B1的表達(dá)（SP，×400）

2.4 IT-PCI法檢測(cè)各組腫瘤組織caspase 6、lamin BI m INA的表達(dá) IT-PCI法檢測(cè)結(jié)果顯示順鉑注射液組、益氣除痰方高劑量組、聯(lián)合用藥組的caspase 6、lamin BI m INA灰度值較模型組升高，有顯著性差異（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組較順鉑注射液組升高，有顯著性差異（P＜0.01），見圖3～5。

表2 免疫組織化學(xué)法各組腫瘤組織Caspase 6、Lam in B1平均光密度值比較（±s，n＝8）

表2 免疫組織化學(xué)法各組腫瘤組織Caspase 6、Lam in B1平均光密度值比較（±s，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與順鉑注射液組比較，▲P＜0.05

Caspase 6　Lamin B1模型組-　 0.31±0.02　0.32±0.03順鉑注射液組　0.002　 0.19±0.02*　0.18±0.03*益氣除痰方低劑量組　3.0　0.28±0.03*▲　0.27±0.03*▲益氣除痰方高劑量組　6.0　0.20±0.01*　0.19±0.02*聯(lián)合用藥組　3.0＋0.002　 0.16±0.02*▲　0.15±0.02*▲組別　　劑量/ （g·kg-1）

圖4 各組腫瘤lam in B1 m RNA的表達(dá)

圖5 RT-PCR檢測(cè)各組腫瘤caspase 6、lamin B1 m RNA灰度值比較（±s，n＝8）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為肺癌致病的病理因素主要為氣虛、血虛、陰虛、陽虛、氣滯、血瘀、痰結(jié)、熱毒8種，其中以氣虛、痰結(jié)最多見［2］。益氣除痰方以補(bǔ)氣、祛痰為基本治療原則，方中人參、白術(shù)健脾補(bǔ)氣，云茯苓滲濕利水、健脾和胃，生半夏、枳殼、葶藶子除痰消積，諸藥合用可健脾益氣、祛痰消積、行氣寬中。經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，“益氣除痰方”及以益氣除痰法為主研究的系列抗肺癌中成藥，臨床研究均證明有較好的抗癌效果。前期工作研究以“益氣除痰方”含藥血清處理人類肺癌A549細(xì)胞，流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)中藥血清處理后，肺癌A549細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)，表明益氣除痰方有一定的抗肺癌細(xì)胞凋亡作用［3］。

腫瘤的生成原因?yàn)榧?xì)胞的異常增殖和細(xì)胞的凋亡受到抑制，由此可見細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在刺激信號(hào)作用下，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而引發(fā)的由基因控制的主動(dòng)死亡過程［4］。其形態(tài)學(xué)上的變化主要是DNA破碎、染色質(zhì)凝聚，繼而細(xì)胞皺縮、線粒體腫脹，最終凋亡小體的形成并被吞噬［5］。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一組由半胱氨酸所產(chǎn)生的蛋白水解酶，參與細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移和細(xì)胞免疫功能，同時(shí)其也可影響各種調(diào)控因子的分泌并調(diào)節(jié)衰老細(xì)胞凋亡的數(shù)量和質(zhì)量［6］。Caspase家族介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，首先通過水解天冬氨酸殘基C末端的肽鍵，激活下游的Caspase酶或分解細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝的改變，最后引起細(xì)胞凋亡［7］。Caspase 6是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的成員，是已知的凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶，位處級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游。Caspase 6以無活性的酶原形式合成，但當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)予以刺激時(shí)，激活上游蛋白，剪切并重組成活性形式從而被激活，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］。

核纖層蛋白（Lamins）是核纖層的關(guān)鍵形成部分之一，而核纖層則對(duì)維持細(xì)胞核形態(tài)有關(guān)鍵作用［9］。Lamin B1是一類細(xì)絲狀多肽，也核纖層蛋白的成分之一，在維持核仁的完整性和可塑性上起重要作用，其又作為Caspase 6的特異性天然作用底物可在酶切后改變其結(jié)構(gòu)，可共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［10-11］。

本研究選用益氣除痰方為工具藥，人肺腺癌細(xì)胞A549為靶細(xì)胞建立小鼠肺癌模型，檢測(cè)腫瘤組織中的Caspase家族蛋白Caspase 6及其底物蛋白Lamin B1的表達(dá)，探討益氣除痰方抑制瘤重的機(jī)制。結(jié)果顯示益氣除痰方有一定促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，機(jī)制可能與降低Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)蛋白表達(dá)，破壞細(xì)胞增殖、分化及自我調(diào)控功能有關(guān)。

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*通信作者：王淑美（1969—），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)腫瘤臨床及抗腫瘤中藥藥理研究。Te1：18716369329，E-mai1：winna968@sina.com

作者簡(jiǎn)介：李 舒（1990—），女，碩士生，主要從事中醫(yī)腫瘤學(xué)研究。Te1：13399855115，E-mai1：794260144@qq.com

基金項(xiàng)目：重慶市科委課題（渝科發(fā)計(jì)字［2013］22號(hào)）

收稿日期：2014-11-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.045

中圖分類號(hào)：I285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0683-04