徐 倩， 杜 超， 蘇花衛(wèi)， 周曉慧*， 肖艷紅， 王 暢（.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；.承德石油高等專科學(xué)校，河北承德067000）

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丹皮酚對(duì)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

徐 倩1， 杜 超1， 蘇花衛(wèi)2， 周曉慧1*， 肖艷紅1， 王 暢1
（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2.承德石油高等專科學(xué)校，河北承德067000）

摘要：目的 觀察丹皮酚對(duì)醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用，以及對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制劑-α（IκB-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）表達(dá)的影響，探討其抗心室重構(gòu)的可能的分子機(jī)制。方法 將培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞分為正常對(duì)照組，醛固酮組，丹皮酚低、中、高劑量組，卡托普利組，通過(guò)MTT法檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞（FBCs）活性，采用Western b1ot法檢測(cè)各組FBCs中IκB-α、MMP9蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，醛固酮組FBCs活力明顯升高（P＜0.01）。與醛固酮組相比，丹皮酚低劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05），丹皮酚中、高劑量組和卡托普利組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）。與正常對(duì)照組比較，醛固酮組FBCs中IκB-α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。與醛固酮組相比，丹皮酚各劑量組、卡托普利組的IκB-α蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。與正常對(duì)照組比較，醛固酮組FBCs中MMP9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。與醛固酮組相比，丹皮酚各劑量組、卡托普利組的MMP9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論 丹皮酚對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的FBCs增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與上調(diào)FBCs中IκB-α蛋白表達(dá)，下調(diào)MMP9蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丹皮酚；心臟成纖維細(xì)胞；IκB-α；MMP9

慢性充血性心力衰竭是各種嚴(yán)重心臟疾病最后階段所表現(xiàn)出來(lái)的癥狀，嚴(yán)重危害患者的身體健康。近年來(lái)，研究表明心室重構(gòu)在心衰發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。醛固酮（a1dosterone，ALD）可誘發(fā)心肌纖維化，促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)心室重構(gòu)。

文獻(xiàn)報(bào)道丹皮酚在整體水平改善大鼠心梗后的心室重構(gòu)，但未有細(xì)胞水平的報(bào)道。本研究以新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞（fibrob1ast ce11s，F(xiàn)BCs）為研究對(duì)象，以醛固酮為誘導(dǎo)因子建立成纖維細(xì)胞增殖模型，首次在細(xì)胞水平觀察丹皮酚對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的干預(yù)作用，確證丹皮酚對(duì)心室重構(gòu)的改善作用。探討醛固酮誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖的可能的分子機(jī)制，為防止使用藥物干預(yù)和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白酶、醛固酮、MTT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。丹皮酚購(gòu)自寧波天真制藥有限公司，批號(hào)為20110603。IκB-α一抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；IκB-α二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MMP9一抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；MMP9二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；β-Actin一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 HEIAce11 150I型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；CKX415F型倒置顯微鏡購(gòu)自日本O1ympus公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CC6離心機(jī)購(gòu)自北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 大鼠心臟成纖維細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng) 取新出生1～3 d的乳鼠20～30只，用75%的酒精消毒并處死。取乳鼠心臟的大部分放入D-Hanks液中，反復(fù)清洗組織，以去掉其中的血管。將心臟組織剪碎，放入三角燒瓶?jī)?nèi)，加入20～30倍組織體積的胰酶消化液，磁力攪拌器上攪拌8 min，轉(zhuǎn)移消化液至離心管內(nèi)，加入4～5滴小牛血清使胰酶滅活。消化過(guò)程可重復(fù)7～8次，直至組織消化完全。1 000 r/min離心10 min，用D-Hanks液洗細(xì)胞。重復(fù)離心操作1次。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)90 min后取出培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)液棄去，再加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待心臟成纖維細(xì)胞達(dá)80%融合，用D-Hanks液沖洗細(xì)胞2次，加入1 m L 0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA（乙二胺四乙酸）混合消化液消化傳代。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)用第3代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組如下。①正常對(duì)照組。加DMEM培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）；②醛固酮組。加含10-7mo1/L醛固酮、5%%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；③丹皮酚低劑量組。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.15 mmo1/L丹皮酚的DMEM培養(yǎng)基；④丹皮酚中劑量組。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.3 mmo1/L丹皮酚的DMEM培養(yǎng)基；⑤丹皮酚高劑量組。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.6 mmo1/L丹皮酚的DMEM培養(yǎng)基；⑥卡托普利組。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、1 mg/mL卡托普利的DMEM培養(yǎng)基。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 原代培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞達(dá)到85%融合后，0.08%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1.0×105/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞達(dá)到85%融合時(shí)，除棄原培養(yǎng)液，每孔加入無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL，使細(xì)胞同步化。24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組施加干預(yù)因素。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)只有培養(yǎng)液的空白對(duì)照。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后，每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，用移液器吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩溶解后，在波長(zhǎng)490 nm下，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值（A）。

1.6 Western b1ot檢測(cè)各組FBCs中IκB-α、MMP9蛋白的表達(dá) 將第3代各分組FBCs以1.0×108/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞達(dá)到約85%融合時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白。每瓶約加入細(xì)胞裂解液160 μL，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取35 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳，5%的濃縮膠，12%的分離膠（IκB-α、β-Actin），8%的分離膠（MMP9），轉(zhuǎn)膜120 min，5%進(jìn)口脫脂奶粉封閉過(guò)夜，1∶200稀釋的IκB-α、MMP9一抗4℃孵育至少2 h，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜15、10、10 min后，與ECL作用3 min，在暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)各組FBCs活力 模型組醛固酮組FBCs活力明顯升高（P＜0.01）。而加入不同質(zhì)量濃度的丹皮酚后，高劑量組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），而且高劑量組細(xì)胞活力幾乎與陽(yáng)性對(duì)照卡托普利組無(wú)差別（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 Western b1ot檢測(cè)各組FBCs中IκB-α蛋白的表達(dá) 醛固酮組IκB-α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。加入不同質(zhì)量濃度的丹皮酚后，各劑量組IκB-α蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01），而且高劑量組細(xì)胞活力幾乎與陽(yáng)性對(duì)照卡托普利組無(wú)差別（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

表1 各組FBCs活力（±s，n＝6）

表1 各組FBCs活力（±s，n＝6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與醛固酮組比較，△△P＜0.01

組別　　吸光度值（A）正常對(duì)照組0.375 4±0.024 2醛固酮組　0.647 6±0.028 9**丹皮酚低劑量組　0.613 8±0.031 9丹皮酚中劑量組　0.536 9±0.035 2△△丹皮酚高劑量組　0.457 2±0.032 4△△卡托普利組　0.419 3±0.034 6△△

圖1 各組FBCs中IκB-α蛋白的表達(dá)水平

表2 各組FBCs中IκB-α蛋白的表達(dá)水平（±s，n＝6）

表2 各組FBCs中IκB-α蛋白的表達(dá)水平（±s，n＝6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與醛固酮組比較，△△P＜0.01

組別　IκB-α/β-Actin正常對(duì)照組1.304 9±0.028 3醛固酮組　0.216 4±0.024 5**丹皮酚低劑量組　0.423 8±0.031 9△△丹皮酚中劑量組　0.445 1±0.036 2△△丹皮酚高劑量組　1.126 9±0.028 4△△卡托普利組　1.198 3±0.031 7△△

2.3 Western b1ot檢測(cè)各組FBCs中MMP9蛋白的表達(dá) 醛固酮組FBCs中MMP9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），加入不同質(zhì)量濃度的丹皮酚后，各劑量組MMP9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組FBCs中MMP9蛋白的表達(dá)水平

表3 各組FBCs中MMP9蛋白的表達(dá)水平（±s，n＝6）

表3 各組FBCs中MMP9蛋白的表達(dá)水平（±s，n＝6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與醛固酮組比較，△△P＜0.01

組別　MMP9/β-Actin正常對(duì)照組0.814 6±0.031 4醛固酮組　2.623 9±0.027 8**丹皮酚低劑量組　2.573 8±0.032 3△△丹皮酚中劑量組　2.524 3±0.035 9△△丹皮酚高劑量組　2.106 5±0.031 6△△卡托普利組　1.514 7±0.026 5△△

3 討論

心肌細(xì)胞數(shù)量的減少和細(xì)胞形態(tài)的變化是心室重構(gòu)最主要的特征，此外還包括細(xì)胞間質(zhì)成分、含有量的變化。心室重構(gòu)主要是指心室結(jié)構(gòu)的改變，一般表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞肥大、膠原組織增生［1］。心室重構(gòu)可增加心肌僵硬度，降低心肌順應(yīng)性，最終導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等［2］。心室重構(gòu)常繼發(fā)于心肌梗死，可嚴(yán)重影響心臟的功能。在心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的全過(guò)程中都存在著心室重構(gòu)，心室重構(gòu)是細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)的改變，其中心臟大小和功能的改變是其在臨床上的主要表現(xiàn)［3］。

醛固酮（a1dosterone，ALD）是腎上腺皮質(zhì)合成并分泌的鹽皮質(zhì)激素，是一種類(lèi)固醇激素，可調(diào)節(jié)鈉、鉀代謝。醛固酮可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖［4］，促進(jìn)膠原合成，誘發(fā)室性心律失常，因此研究表明醛固酮是心血管疾病新的危險(xiǎn)因素之一［5］。

丹皮酚（paeono1，Pae）又名牡丹酚，可從牡丹皮、徐長(zhǎng)卿等中藥中提取得到。丹皮酚藥理活性眾多，文獻(xiàn)報(bào)道丹皮酚可抗心律失常、保護(hù)心臟［6］。本研究采用新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，以醛固酮為誘導(dǎo)因子建立成纖維細(xì)胞增殖模型，探討丹皮酚是否抑制成纖維細(xì)胞的增殖及其發(fā)揮作用的可能的分子機(jī)制。

本研究采用10-7mo1/L醛固酮作用于FBCs，使細(xì)胞增殖。研究結(jié)果顯示，醛固酮組FBCs增殖顯著，光鏡下可見(jiàn)FBCs密度增大，數(shù)量增多。丹皮酚中高劑量組細(xì)胞活力降低，細(xì)胞數(shù)量減少。并且丹皮酚高劑量組的細(xì)胞活力與陽(yáng)性對(duì)照卡托普利組幾乎無(wú)差別。這說(shuō)明丹皮酚可以抑制FBCs的增殖。

近年來(lái)研究結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)對(duì)于慢性充血性心衰的發(fā)生發(fā)展具有重要作用［7］。文獻(xiàn)報(bào)道核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。一般情況下，在細(xì)胞質(zhì)中，NF-κB與IκB結(jié)合在一起，呈非活性狀態(tài)［8］。細(xì)胞受到刺激后，IκB激酶被激活，IκB磷酸化泛素化后被降解，NF-κB從多聚體上解離出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核，與模板DNA結(jié)合在一起，從而調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子等的基因表達(dá)［9］，使細(xì)胞因子、黏附分子表達(dá)增多［10］。

NF-κB可以通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix meta11oproteinases，MMPs）表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝［11-12］，進(jìn)而調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞增殖。MMPs是一類(lèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分的重要酶系［13］，因發(fā)揮作用時(shí)需要Ca2＋、Zn2＋等金屬離子而得名［14］。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員之一，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原和明膠。

本研究結(jié)果顯示，醛固酮組IκB-α蛋白的表達(dá)降低，MMP9蛋白表達(dá)增強(qiáng)；而用丹皮酚干預(yù)后IκB-α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，MMP9蛋白表達(dá)降低。這表明丹皮酚可抑制IκB-α蛋白的降解，抑制其下游MMP9的表達(dá)，也就是說(shuō)丹皮酚可能抑制NF-κB通路的基因蛋白表達(dá)，從而抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖。

綜上所述，丹皮酚對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的FBCs增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與影響FBCs中NF-κB通路中MMP9、IκB-α的蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究將為把中藥丹皮酚開(kāi)發(fā)成抗心衰的新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 杜 超，周曉慧，徐 倩，等.血管緊張素系統(tǒng)對(duì)心室重構(gòu)的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，27（3）：549.

［2］ 張瑞英，孫藝紅，富 路，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和AT1受體拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠心室重構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2005，25（1）：36-38.

［3］ CohrJN，F(xiàn)errari I，Sharpe N.Cardiac remode1ing-concepts and c1inica1imp1ication：a consensus paper from an internationa1 forum on cardiac remode1ing.Beha1f of an internationa1 forum on cardiac remode1ing［J］.JAm Coll Cardiol，2000，35（3）：569-582.

［4］ Neumann S，Huse K，Semrau I，etal.A1dosterone and D-g1ucose stimu1ate the pro1iferation of human cardiac myofibrob1asts in vitro［J］.Hypertension，2002，39（3）：756-760.

［5］ Iocha I，Wi11amsGH.Iationa1e for the use of a1dosterone antagonists in congestive heart fai1ure［J］.Drugs，2002，62（5）：723-731.

［6］ 張 艷，范俊安.中藥材牡丹皮研究概況Ⅳ丹皮藥理作用研究概況［J］.重慶中草藥研究，2009，6（1）：24-31.

［7］ Parish I C，Evans JD.Inf1ammation in chronic heart fai1ure ［J］.Ann Pharmacother，2008，42（7）：1002-1016.

［8］ Kausha1V，Sch1ichter L C.Mechanisms ofmicrog1ia-mediated neurotoxicity in a new mode1of the stroke penumbra［J］.JNeurosci，2008，28（9）：2221-2230.

［9］ 徐 倩，周曉慧，曹 凱，等.同型半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IκB和NF-κB表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2011，39 （5）：438-441.

［10］ Bond M，Baker A H，Newby A C.Nuc1ear factor-kappaB activity is essentia1 formatrixmeta11oproteinase-1 and -3 upregu1ation in rabbit derma1 fibrob1asts［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，264（2）：561-567.

［11］ Wu C Y，Wu C J，Tseng C C，et al.He1icobacter py1ori promote gastric cancer ce11s invasion through a NF-κB and COX-2-mediated pathway［J］.World JGastroenterol，2005，11（21）：3197-3203.

［12］ 朱佳蕾，鄧夏珩，高 麗，等.白藜蘆醇通過(guò)核因子-κB信號(hào)通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，3（33）：1073-1075.

［13］ Zhao Q，Liu ZD，Xue Y，etal.Ds-echinoside A，a new triterpene g1ycoside derived from sea cucumber，exhibits antimetastatic activity via the inhibition of NF-κB-dependentMMP-9 and VEGF expressions［J］.J ZheJiang Univ Sci B，2011，12（7）：534-544.

［14］ Nagase H，Woessner J F Jr.Matrix meta11oproteinases［J］.J Biol Chem，1999，274（31）：491-494.

*通信作者：周曉慧（1957—），女，碩士，教授，從事心血管藥理學(xué)的研究。Te1：18931416039

作者簡(jiǎn)介：徐 倩（1984—），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事心血管藥理學(xué)的研究。Te1：18932896530，E-mai1：sdwssnow@163.com

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金（C2011406009）

收稿日期：2015-12-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.039

中圖分類(lèi)號(hào)：I966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0662-03