吳曉敏， 周毅生， 楊俊騰， 莫海珊（廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006）

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反向分子對(duì)接法預(yù)測(cè)龍須藤兩種多甲氧基黃酮的分子靶標(biāo)

吳曉敏， 周毅生*， 楊俊騰， 莫海珊
（廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：目的 預(yù)測(cè)龍須藤兩種多甲氧基黃酮5，7，3＇，4＇，5＇-五甲氧基黃酮（PMFA）及5，6，7，5＇-四甲氧基-3＇，4＇-亞甲二氧基黃酮（TMFA）的分子靶標(biāo)。方法 采用反向分子對(duì)接法，對(duì)這兩種成分進(jìn)行分析。結(jié)果 PMFA和TMFA可能在抗癌、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及抗心血管疾病等方面發(fā)揮作用，并通過防止CTSK與DHODH靶點(diǎn)作用于To11樣受體、破骨細(xì)胞分化與嘧啶代謝等途徑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。結(jié)論 該方法可為龍須藤及兩種多甲氧基黃酮的藥效學(xué)及分子作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)提供參考。

關(guān)鍵詞：龍須藤；PMFA；TMFA；分子靶標(biāo)；反向分子對(duì)接

KEYW 0RDS：Bauhinia championii（benth.）Benth.；PMFA；TMFA；mo1ecu1e targets；inversemo1ecu1e docking

龍須藤為豆科蘇木亞科羊蹄甲屬植物龍須藤Bauhinia championii（benth.）Benth.的干燥藤莖，是一味畬醫(yī)病證論治中針對(duì)痹癥，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（IA）的特色藥［1-2］，其活性成分很多，但目前相關(guān)研究主要集中于其不同有機(jī)溶劑提取物的藥理作用上，而對(duì)其有效單體成分及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分子機(jī)制的研究較少。5，7，3＇，4＇，5＇-五甲氧基黃酮（PMFA）及5，6，7， 5＇-四甲氧基-3＇，4＇-亞甲二氧基黃酮（TMFA）為龍須藤兩種活性成分［3］，具有抗炎活性［3-6］，但迄今國(guó)內(nèi)對(duì)兩者的相關(guān)藥理研究仍較少，其抗炎機(jī)制也不明確。在藥物的開發(fā)研究過程中，為彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥物研發(fā)手段的盲目性及高成本，以計(jì)算機(jī)為工具進(jìn)行理論模擬、計(jì)算和預(yù)測(cè)，為藥物開發(fā)提供理論指導(dǎo)信息的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)（CADD）越來越受到重視［7-8］。其中，以小分子化合物（天然產(chǎn)物、先導(dǎo)化合物及化學(xué)合成物）為探針，在已知結(jié)構(gòu)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)搜尋可能與之結(jié)合的生物大分子，并通過空間和能量匹配相互識(shí)別形成分子復(fù)合物，從而預(yù)測(cè)藥物潛在作用靶點(diǎn)的反向分子對(duì)接技術(shù)，在探索小分子的藥理作用及機(jī)制等方面得到廣泛的認(rèn)可［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)以龍須藤兩種多甲氧基黃酮PMFA及TMFA為研究對(duì)象，利用反向分子對(duì)接法對(duì)其潛在作用靶標(biāo)進(jìn)行虛擬篩選和分析，一方面可為兩者潛在的藥理作用提供參考，而另一方面可為龍須藤的藥理作用機(jī)制研究起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

在Mo1inspiration網(wǎng)站（http：//www.mo1inspiration.com/）中畫出PMFA和TMFA的分子結(jié)構(gòu)（圖1），計(jì)算出可以作為兩者吸收的預(yù)測(cè)參數(shù)，再根據(jù)藥物吸收五原則［10］評(píng)價(jià)其吸收性質(zhì)。將PMFA 與TMFA小分子以3Dmo12文件提交給PharmMapperper server（http：//59.78.96.61/pharmmapper/he1p. php）進(jìn)行優(yōu)化，生成多種構(gòu)象，選擇人類蛋白靶標(biāo)庫(kù)，其他參數(shù)選為默認(rèn)，對(duì)配體小分子與其數(shù)據(jù)庫(kù)中的藥效團(tuán)自動(dòng)匹配，并使其按匹配的z’-score打分高低排序［11］。將z’-score＞0的所有靶點(diǎn)作為分析對(duì)象，利用PDTD（http：//www.dddc.ac.cn/pdtd/ benchmark.php）、Drubank（http：//www.drugbank. ca/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd. asp）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物-靶點(diǎn)-疾病分析歸類，利用京都基因與基因組百科全書（the Kyoto Encyc1opedia of Genes and Genomes，KEGG，http：//www.genome. jp/kegg/）通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋和分析。

圖1 PMFA和TMFA的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of PMFA and TMFA

2 結(jié)果

2.1 PMFA與TMFA的吸收預(yù)測(cè) Mo1inspiration網(wǎng)站對(duì)PMFA進(jìn)行吸收性質(zhì)預(yù)測(cè)，吸收參數(shù)為相對(duì)分子質(zhì)量（MW）＝372.373、氫鍵給體（nOHNH）＝0、氫鍵受體（nON）＝8、脂水分配系數(shù)（miLogP）＝3.386；對(duì)TMFA進(jìn)行吸收性質(zhì)預(yù)測(cè)，吸收參數(shù)為相對(duì)分子質(zhì)量（MW）＝388.372、氫鍵給體（nOHNH）＝0、氫鍵受體（nON）＝7、水分配系數(shù)（miLogP）＝2.665。結(jié)果，兩者均符合五原則中氫鍵給體、受體、相對(duì)分子質(zhì)量和脂水分配系數(shù)等參數(shù)的要求，表明具有良好的口服吸收性質(zhì)與類藥性。

2.2 PMFA與TMFA潛在靶標(biāo)的反向預(yù)測(cè) 根據(jù)配體反向分子對(duì)接PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果（PMFA的Job ID為141123183037，TMFA的JobID為141123183306），預(yù)測(cè)PMFA有PDB ID編號(hào)不同89個(gè)（相同蛋白名稱為61個(gè)）、TMFA有95個(gè)（64個(gè)）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的潛在分子靶點(diǎn)（i.e.z’-score＞0）。得分最高的前10個(gè)蛋白見表1。

通過對(duì)61個(gè)PMFA與64個(gè)TMFA實(shí)際靶點(diǎn)作進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，由于靶點(diǎn)所涉及的疾病較多，故主要以龍須藤主治疾病進(jìn)行分類，兩者與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點(diǎn)均有2個(gè)，而且蛋白名稱一致（CTSK、DHODH）；與心血管疾病相關(guān)的靶點(diǎn)PMFA有9個(gè)、TMFA有8個(gè)（圖2）。同時(shí)，對(duì)靶點(diǎn)整體分析發(fā)現(xiàn)，PMFA與癌癥相關(guān)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)有20個(gè)、TMFA有24個(gè)（圖3）。

圖2 PMFA和TMFA與心血管疾病相關(guān)靶點(diǎn)Fig.2 Targets related With cardiovascular diseases of PMFA and TMFA

通過人工檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)PMFA和TMFA在心血管及癌癥方面的報(bào)道，但有在炎癥方面的研究［3-6］，因此兩者作為龍須藤活性成分，在抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面的可能性較大，故選擇相應(yīng)2個(gè)靶點(diǎn)CTSK（PMFA的Iank為20、83，TMFA為41）、DHODH（PMFA為62，TMFA為71）作進(jìn)一步分析，PharmMapper提供配體與兩靶蛋白藥效團(tuán)的匹配信息見圖4。PMFA與CTSK （Iank為20，PDB為1BGO）藥效團(tuán)模型中含有4個(gè)疏水性特征、1個(gè)氫鍵供體、4個(gè)氫鍵受體（圖4a）；與CTSK（Iank為83，PDB為1TU6）藥效團(tuán)模型中含有3個(gè)疏水性特征、2個(gè)氫鍵供體、4個(gè)氫鍵受體（圖4b）；與DHODH（Iank為62，PDB為2FPY）藥效團(tuán)模型中含有6個(gè)疏水性特征、1個(gè)負(fù)電荷中心、2個(gè)氫鍵受體（圖4c）。TMFA與CTSK（Iank為41，PDB為1BGO）藥效團(tuán)模型中含有4個(gè)疏水性特征、1個(gè)氫鍵供體、4個(gè)氫鍵受體（圖4d）；與DHODH（Iank為1，PDB 為2FPY）藥效團(tuán)模型中含有6個(gè)疏水性特征、1個(gè)負(fù)電荷中心、2個(gè)氫鍵受體（圖4e）。利用KEGG對(duì)兩靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)其可能通過to11樣受體信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化通路及嘧啶代謝通路發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，見圖5。

表1 得分最高的前10個(gè)蛋白Tab.1 Top 10 proteinsWith the highest scores

圖3 PMFA和TMFA抗癌靶點(diǎn)Fig.3 Anticancer targets of PMFA and TMFA

圖4 PMFA、TMFA相互影響與其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶蛋白藥效模型Fig.4 Pharmacophoremodels of the interactions of PMFA and TM FA and their anti-rheumatoid arthritis target proteins

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要利用Mo1inspiration、PharmMapper、KEGG等生物學(xué)信息手段，對(duì)龍須藤活性多甲氧基黃酮類化合物PMFA與TMFA進(jìn)行吸收、靶點(diǎn)及作用通路的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明兩者可能被吸收，并通過防止組織蛋白酶K與二氫乳清酸脫氫酶作用于To11樣受體、破骨細(xì)胞分化及嘧啶代謝等途徑，用以發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，這為龍須藤治療該疾病的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。在所有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的靶點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)，治療中風(fēng)、高血壓、心肌缺血等心血管疾病有9個(gè)相關(guān)潛在靶點(diǎn)，其中有8個(gè)為兩配體共有，其可作為深入探討龍須藤行氣活血，以治療中風(fēng)偏癱的分子機(jī)制線索。

圖5 PMFA和TMFA抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)及相關(guān)通路Fig.5 Anti-rheumatoid arthritis targets and related path-Ways of PMFA and TMFA

更值得關(guān)注的是，PMFA篩選的61個(gè)靶點(diǎn)中有20個(gè)與癌癥相關(guān)，而64個(gè)TMFA靶點(diǎn)中有24個(gè)，兩者共有17個(gè)，而且在PharmMapper相應(yīng)藥效團(tuán)模型的分值均靠前，其中得分前五名，并與癌癥相關(guān)的靶點(diǎn)為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6 （CDK6）與蛋白激酶2（CDK2），其在兩種多甲氧基黃酮中的篩選結(jié)果排名一致，分別為Iank1與Iank5。在人體細(xì)胞中，CDK6主要控制細(xì)胞循環(huán)G1期，而CDK2則主要控制細(xì)胞循環(huán)G1、G2、S期［12］，兩者均與細(xì)胞增殖凋亡等功能息息相關(guān)。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶家族（CDKs）與相應(yīng)的周期蛋白結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，在真核細(xì)胞周期的各種檢驗(yàn)點(diǎn)中扮演著重要角色，被認(rèn)為是潛在的抗癌因子［13］。根據(jù)反向分子對(duì)接結(jié)果，提示PMFA、TMFA和龍須藤可能與抗癌相關(guān)，故可在后期藥理實(shí)驗(yàn)中研究其治療癌癥的可能性。

然而，雖然CADD因其在提高藥物研發(fā)成功率、降低研發(fā)成本、縮短研發(fā)周期等方面的優(yōu)勢(shì)而成為目前創(chuàng)新藥物研究的核心技術(shù)之一［14］，但計(jì)算數(shù)據(jù)始終不能替代藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要是為藥物開發(fā)提供理論參考，并為后續(xù)分子機(jī)制研究指導(dǎo)方向，故最終還需要傳統(tǒng)藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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［飲片炮制］

Forecast of molecule targets of tWo polymethoxylated flavonoids of Bauhinia championii by inversemolecule docking

WU Xiao-min， ZHOU Yi-sheng*， YANG Jun-teng， MO Hai-shan

（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 5IOOO6，China）

ABSTRACT：AIM To forecast themo1ecu1e targets of two po1ymethoxy1ated f1avonoids（5，7，3＇，4＇，5＇-pentamethoxyf1avone［PMFA］and 5，6，7，5＇-tetramethoxy-3＇，4＇-methy1endioxyf1avone［TMFA］）of Bauhinia championii（benth.）Benth..METH 0DS These two constituents were ana1yzed by inversemo1ecu1e docking. RESULTS PMFA and TMFA might p1ay an important ro1e in resisting cancers，rheumatoid arthritis and cardiovascu1ar diseases，which treated rheumatoid arthritis through preventing CTSK and DHODH from acting on to11-1ike receptor，osteoc1ast differentiation and pyrimidine metabo1ism pathways.C0 NCLUSI0N Thismethod can provide a reference for the pharmacodynamics and mo1ecu1armechanisms of action of two po1ymethoxy1ated f1avonoids and Bauhinia championii.

*通信作者：周毅生（1957—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事藥物新劑型與新技術(shù)的研究。Te1：（020）39352168，E-mai1：yishzhou @a1iyun.com

作者簡(jiǎn)介：吳曉敏（1992—），女，碩士，從事中藥制劑研究與開發(fā)。Te1：13416191628，E-mai1：wuxiaomin0314@126.com

收稿日期：2015-05-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.027

中圖分類號(hào)：I284.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0603-04