張小琴， 湯晟凌， 呂偉旗（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，麗水市人民醫(yī)院藥劑科，浙江麗水323000）

?

10種含梔子中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的同時測定

張小琴， 湯晟凌*， 呂偉旗
（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，麗水市人民醫(yī)院藥劑科，浙江麗水323000）

摘要：目的 采用HPLC法與一測多評法，同時測定10種含梔子中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量。方法

制劑分析采用Ag1ient1200色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測波長238 nm（0～20 min）、440 nm（20～30 min）；柱溫30℃。結(jié)果 HPLC圖譜的峰形及分離度良好。以梔子苷為內(nèi)標物，西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子為1.085（ISD＝0.73%），其重現(xiàn)性不受色譜柱影響。結(jié)論 除清火梔麥片與小兒清熱片外，其余8種含梔子中藥制劑中梔子苷的含有量均符合藥典標準。

關(guān)鍵詞：中藥制劑；梔子；梔子苷；西紅花苷-Ⅰ；HPLC；一測多評

KEY W 0RDS：traditiona1Chinesemedicina1 preparations；Gardenia Jasminoides；geniposide；crocin-I；HPLC；quantitative ana1ysis ofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）

梔子是茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides E1-1is的干燥成熟果實，性寒，味苦，歸心、肺、三焦，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等功效［1］，是常用的大宗藥材品種之一，臨床用于熱病心煩、黃疸尿赤、目赤腫痛、火毒瘡瘍等癥。目前，市售含梔子中藥制劑的種類繁多，其劑型包括散劑、片劑、丸劑、膠囊劑、注射水劑等，常見的有梔子金花丸、清火梔麥片、八正合劑、三子散、清開靈片等。

環(huán)烯醚萜苷及西紅花苷是梔子的主要有效成分，其中梔子苷是環(huán)烯醚萜類的主要化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梔子苷具有保肝利膽、促進胰腺分泌、自由基損傷拮抗、保護神經(jīng)細胞、抗菌消炎、降血糖與抗腫瘤等作用［2-5］，而西紅花苷具有降壓、改善冠心病心絞痛導(dǎo)致血流變異常、抗血栓、保護血管內(nèi)皮細胞、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、清熱利膽退黃與抗氧化等作用［6-10］?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定，含梔子中藥制劑多以梔子苷含有量為梔子的質(zhì)量標準，但對西紅花苷暫無相關(guān)要求。由于西紅花苷-Ⅰ是西紅花苷類的主要化合物，而且活性顯著［11-12］，故本實驗選取市售10種含梔子的中藥制劑，建立同時測定其中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的HPLC法與一測多評法，考察《中國藥典》規(guī)定的梔子苷標準與西紅花苷-Ⅰ含有量，為含其質(zhì)量標準評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料 Ag1ient1200高效液相色譜儀（美國Ag1ient公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；Mi11i-Q Academic超純水儀（美國Mi11ipore公司）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；FA1004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

梔子苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號116816）；西紅花苷-Ⅰ對照品（純度＞97%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-12071108）。乙腈為色譜純（美國Tedia公司）；水為去離子水；其他試劑均為分析純。市售含梔子中藥制劑共10種，均為《中國藥典》2010年版收錄的成方制劑［1］，具體信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Ag1igent ec1ipse XDB-C18、Thermo Syncronis C18、Syncronis C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長238 nm（0～20 min）、440 nm（20～30 min）；柱溫30℃；進樣量50 μL。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷與西紅花苷-Ⅰ對照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成含0.208 mg/mL梔子苷與0.032 mg/mL西紅花苷-Ⅰ的混合標準品溶液，避光保存，備用。

1.2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取研磨至粉狀的固體樣品0.2 g（精密吸取液體樣品0.2 mL），置于50 mL錐形瓶中，加入75%甲醇溶液25 mL，25℃下超聲提取1 h，抽濾。吸取5 mL，75%甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取梔子苷標準品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，西紅花苷-Ⅰ標準品溶液0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mL，用75%甲醇定容至10 mL量瓶中，在“1.2.1”項色譜條件下測定。以梔子苷與西紅花苷-Ⅰ標準品溶液的質(zhì)量濃度為縱坐標（Y），峰面積為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算出兩者的線性范圍分別為5.20～83.2 μg/mL和0.32～7.68 μg/mL，回歸方程以及相關(guān)系數(shù)分別為Y＝336.85X-290.77，R2＝0.999 0；Y＝149.76X-89.5，R2＝0.999 2。1.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一清開靈片樣品，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，置于以下條件保存。（1）高溫度試驗：40℃，避光；（2）高濕度試驗：室溫，相對濕度（90±5）%，避光；（3）強光照射試驗：室溫，（5 000±500）Lux光照強度下照射。分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣，在“1.2.1”項色譜條件下測定相應(yīng)峰面積，計算出以上條件下梔子苷與西紅花苷-Ⅰ峰面積的ISD值（n＝8）分別為0.89%、1.83%；1.21%、2.08%；10.89%、15.08%。結(jié)果表明，供試品溶液在高濕度與40℃避光條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定，而在強光照射條件下不穩(wěn)定，故本實驗樣品均在室溫24 h內(nèi)避光條件下測定含有量。

表1 制劑基本信息Tab.1 Basic information of the preparations

1.2.5 精密度試驗 取梔子苷標準品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得梔子苷峰面積ISD值為1.99%，西紅花苷-Ⅰ峰面積ISD值為2.08%，表明儀器精密度良好。

1.2.6 重復(fù)性試驗 取同一清開靈片樣品6份，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定梔子苷與西紅花苷-Ⅰ含有量，得前者平均含有量為0.368%，ISD值為2.35%，后者平均含有量為0.023 1%，ISD值為0.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的三子散適量，精密加入梔子苷與西紅花苷-Ⅰ對照品，配制成供試品溶液進行測定，計算公式為加樣回收率＝（H3-H1）/H2×100%（H1為樣品中被測成分的含有量，H2為加入對照品的含有量，H3為實際測得含有量）。結(jié)果，梔子苷實際測得質(zhì)量濃度在11.98～12.08 μg/mL之間，而西紅花苷-Ⅰ在1.267～1.299 μg/mL之間，均在各自線性范圍內(nèi)。同時，前者平均回收率為99.41%，ISD值為0.86%（n＝6），而后者平均回收率為100.01%，ISD值為0.76%（n＝6），具體見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n＝6）

1.2.8 樣品含有量測定 精密稱取研磨至粉狀的固體樣品0.2 g（精密吸取液體樣品0.2 mL），置于50 mL帶塞錐形瓶中，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下，對10種中藥制劑樣品中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量進行測定，重復(fù)3次。

1.2.9 相對校正因子的測定 以梔子苷為內(nèi)標物，測定西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子，計算公式為fks＝（Wk×A＇s）/（Ws×A＇k）［13-14］（W為進樣量，A＇為峰面積，s為梔子苷，k為西紅花苷-Ⅰ）。結(jié)果，西紅花苷-Ⅰ的平均校正因子為1.085，ISD值為0.73%，詳見表3。

表3 西紅花苷-Ⅰ的相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of crocin-I

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥制劑中梔子苷與西紅苷-I含有量的HPLC法優(yōu)化 在文獻［12，15-16］的基礎(chǔ)上，對這兩種成分的提取方法進行優(yōu)化，分別考察了50%、75%、85%甲醇，40、60、80 min提取時間，20、25、30、35℃提取溫度下兩者的提取效率。結(jié)果顯示，市售中藥制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ在75%甲醇、25℃的條件下，超聲提取1 h即可被完全提取，而且操作簡便，雜質(zhì)少。此外，還考察了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水流動相與梯度程序，發(fā)現(xiàn)兩者在乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）流動相下梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）時，出峰效果與分離度最好，具體見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 制劑中梔子苷含有量比較 10種含梔子的中藥制劑均為2010年版《中國藥典》收錄的成方制劑，其質(zhì)量標準規(guī)定均包括梔子苷含有量。在本實驗優(yōu)化的HPLC方法下，10種中藥制劑中梔子苷的含有量存在差異，見表4。其中，以三子散為最高，達0.781%，而清開靈注射液最低，僅0.058%，平均0.278%。另外，除清火梔麥片與小兒清熱片藥典無商品規(guī)格，故無法等量換算梔子苷標準外，其余8種制劑中梔子苷含有量均達到藥典標準。

表4 制劑中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量Tab.4 Contents of geniposide and crocin-I in the preparations

2.3 制劑中西紅花苷-Ⅰ含有量比較 10種中藥制劑中西紅花苷-Ⅰ的含有量存在差異，其中以三子散為最高，達0.063 8%，而清火梔麥片最低，僅0.004 2%，平均0.027 2%。為方便與本實驗結(jié)果比較，根據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定的梔子苷標準，將其換算成百分含有量，換算公式為標準百分含有量＝梔子苷限度值/單位規(guī)格質(zhì)量× 100%，具體見表4。

2.4 一測多評法與HPLC法結(jié)果比較 根據(jù)西紅花苷-Ⅰ的相對校對因子，用一測多評法測得供試樣品中西紅花苷-Ⅰ的含有量，見表4。由表可知，其平均含有量為0.026 8%，與HPLC法（0.027 2%）無顯著性差異（P＞0.05），表明一測多評法可用于中藥制劑中的多指標成分的質(zhì)量評價，具有較好的可信度。

3 結(jié)論與討論

長期以來，中成藥的質(zhì)量大多以單一指標進行控制，難以真正體現(xiàn)中藥的多效性和整體性。中藥多靶點的作用特點要求對其進行多成分質(zhì)量控制，因此相關(guān)模式應(yīng)運而生，但商品化對照品的供不應(yīng)求和多指標控制高昂的檢測費用限制了其在實際生產(chǎn)、科研和監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用，而一測多評法為解決該矛盾提供了新思路，但是中藥復(fù)方制劑的成分種類比單味中藥飲片更多、更復(fù)雜，其應(yīng)用難度更大［17-20］。因此，檢測波長的確定、內(nèi)參物的選擇、色譜峰的定位、校正因子的重現(xiàn)性等因素都影響著該方法的可靠性。

梔子苷與西紅花苷-Ⅰ是含梔子中藥制劑中的主要化學(xué)成分，由于兩者保留時間較近，故為本實驗一測多評法的建立提供了良好的應(yīng)用基礎(chǔ)。在內(nèi)標物的選擇上，由于梔子苷含有量相對較高，分離度與穩(wěn)定性較好，并且其標準品易得，價格低廉，而西紅花苷對照品價格昂貴，故選擇梔子苷為內(nèi)標物。分別兩者色譜峰進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)前者的最大吸收波長為238 nm，而后者為440 nm，故選擇238 nm與440 nm為梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的檢測波長。當(dāng)僅使用梔子苷對照品時，鑒于西紅花苷色譜峰與其色譜峰的保留時間較近，因此選用相對保留時間來定位目標色譜峰。分別用Agi1ent ec1ipse XDB-C18、Thermo Syncronis C18、Syncronis C183種色譜柱考察校正因子的重現(xiàn)性，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱對其影響較小（ISD＜3.0%），重復(fù)性較好，由于實驗條件所限，故未對不同色譜儀考察校正因子重復(fù)性，將在后續(xù)工作中予以補充。

同時，本實驗考察了甲醇濃度、提取時間、流動相等因素對含有量測定的影響。結(jié)果表明，梔子苷與西紅花苷-Ⅰ在75%甲醇、25℃條件下超聲提取1 h即可被完全提取，在乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）流動相下梯度洗脫（0 min，1∶9；15 min，2∶8；30 min，3∶7）時，出峰效果與分離度最好。而且，一測多評法與HPLC法的分析結(jié)果無明顯差異，均可用于同時測定這兩種成分的含有量，此外在西紅花苷標準品稀缺時，可優(yōu)先選用一測多評法。

2010年版《中國藥典》收錄的成方制劑中，含梔子的中藥制劑就有數(shù)十種之多，其中以梔子為主要成分，并規(guī)定梔子苷含有量標準的也有十余種，但均無西紅花苷標準。本實驗選取市售10種含梔子的中藥制劑，建立一測多評法與HPLC法同時測得其中梔子苷與西紅花苷-Ⅰ的含有量，可為含該制劑的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。同時，比較了10種制劑中這兩種成分的含有量，發(fā)現(xiàn)除清火梔麥片與小兒清熱片在2010年版《中國藥典》中無商品規(guī)格，無法等量換算梔子苷標準外，其余8種制劑梔子苷含有量均達到藥典標準。因此，建議2015年版《中國藥典》完善清火梔麥片與小兒清熱片的“商品規(guī)格“一欄，同時在含有量測定指標中考慮增加西紅花苷類成分。

參考文獻：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］ 姚冬冬，舒 孌，楊 蕾，等.梔子及其活性成分梔子苷防治糖尿病作用機制研究進展［J］.中國中藥雜志，2014，39（8）：1368-1373.

［3］ 師永清，師永花.HPLC同時測定牛黃清胃丸中梔子苷和黃芩苷［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：86-88.

［4］ 王志超，楊小龍，張 珂，等.梔子苷藥理作用的研究進展［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，30（2）：159-160.

［5］ 顏靜恩，李晚忱，呂秋軍，等.梔子苷的降糖作用和對PPAIγ受體的激活［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，25 （4）：415-418.

［6］ 朱 波，施林妹，徐象華，等.不同遮蓋方式對番紅花生長發(fā)育的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：232-233.

［7］ 劉 瑛，古天明，周 紅.西紅花苷類成分藥理作用研究概況［J］.成都大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，27（1）：16-19.

［8］ 緒廣林，余書勤，龔祝南，等.西紅花苷對大鼠實驗性高脂血癥的影響及其機制研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（5）：369-372.

［9］ 侯金燕，羅 琳，竇志華，等.HPLC-DAD測定茵陳蒿湯中兒茶素、綠原酸、西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（6）：48-51.

［10］ 張曉巖，喻 靜，張先鈞，等.西紅花苷-1對急性低氧條件下大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬SIIT1表達的影響［J］.中草藥，2013，44（10）：1314-1317.

［11］ 施林妹，徐象華，朱 波，等.西紅花主要活性成分含量變異規(guī)律［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（13）：113-116.

［12］ 羅光明，陳 巖，李 霞，等.不同居群品系梔子中梔子苷和西紅花苷-1含量的比較研究［J］.中藥材，2010，33 （9）：1376-1378.

［13］ 張 勇，張 玲，謝曉梅.一測多評法同時測定木瓜中2種常見三萜酸［J］.中成藥，2013，35（4）：770-773.

［14］ 劉 圓，魏惠珍，龔建平，等.一測多評法測定健脾丸中4種黃酮類成分［J］.中成藥，2015，37（5）：995-999.

［15］ 付建武，彭 紅，周玉春，等.高效液相色譜波長轉(zhuǎn)換法測定西紅花苷-1和梔子苷的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：2939-2940.

［16］ 石鳳鳴，王文君，陳 雛，等.梔子指紋圖譜及不同生長期西紅花苷和梔子苷含量的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（8）：1874-1876.

［17］ 馮偉紅，楊 菲，王智民，等.一測多評法與外標法測定雙黃連制劑中黃酮類成分含量的比較分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，47（20）：1665-1669.

［18］ 高慧敏，宋宗華，王智民，等.適合中藥特點的質(zhì)量評價模式—QAMS研究概述［J］.中國中藥雜志，2012，37 （4）：405-416.

［19］ 趙 倩，馮偉紅，張啟偉，等.“一測多評”法用于梔子金花丸多成分含量測定的可行性研究［J］.中國中藥雜志，2014，39（10）：1826-1833.

［20］ 劉志輝，顧 瑋，常星潔，等.“一測多評”法測定麥貞花顆粒中不同類型成分的含有量［J］.中成藥，2012，34 （12）：2342-2347.

Simultaneous determ ination of geniposide and crocin-I in ten traditional Chinese medicinal preparations containing Gardenia jasm inoides

ZHANG Xiao-qin， TANG Cheng-1ing*， LVWei-qi

（The Siχth Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University；Department of Pharmacy，Lishui People’s Hospital，Lishui323OOO，China）

ABSTRACT：AIM To simu1taneous1y determine the contents of geniposide and crocin-I in ten traditiona1Chi-book=570,ebook=104nesemedicina1preparations containing Gardenia Jasminoides by HPLC and quantitative ana1ysis ofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）.METH0DS The ana1yses of preparations were conducted on Ag1ient 1200 co1umn，mobi1e phase was acetonitri1e-0.1% phosphorus acid in a gradient e1ution manner，detection wave1engths were set at238 nm（0 -20 min）and 440 nm（20 -30 min），and co1umn temperature wasmaintained at 30℃.RESULTS Manifesting good peaks and reso1utions of HPLC chromatograms，crocin-Idisp1ayed its re1ative correction factor of1.085（ISD＝0.73%）with geniposide as the interna1standard，whose reproducibi1itywas independentof co1umns.C0NCLUSI0N Except for Qinghuo Zhimai Tab1ets and Xiao’er Qingre Tab1ets，another eight traditiona1Chinesemedicina1preparations containing Gardenia Jasminoides accord with Chinese Pharmacopoeia criteria.

*通信作者：湯晟凌（1977—），女，副主任藥師，從事中藥新藥開發(fā)與臨床藥學(xué)研究。E-mai1：aurora0119@163.com

作者簡介：張小琴，女，主管藥師，從事醫(yī)院制劑與中成藥活性成分研究。E-mai1：1stracy1027@163.com

收稿日期：2015-09-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.019

中圖分類號：I 927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0569-06