馬君義， 陳香玲， 盛愛霞， 宋麗萍， 張 繼（.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

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載高烏甲素殼聚糖納米粒的制備及其體外釋藥特性

馬君義1，2， 陳香玲1， 盛愛霞1， 宋麗萍1， 張 繼1，2
（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

摘要：目的 制備載高烏甲素殼聚糖納米粒，并考察其體外釋藥特性。方法 以殼聚糖為載體材料，以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，采用微乳液-離子交聯(lián)法制備納米粒。以包封產(chǎn)率和載藥量為主要評價(jià)指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝。結(jié)果 納米粒呈球形或類球形，平均粒徑為334 nm，在30 h內(nèi)穩(wěn)定。高烏甲素的包封產(chǎn)率和載藥量分別為（35.34±0.94）%、（2.25±0.08）%。結(jié)論 該工藝簡便可靠，制備的納米粒具有明顯的緩釋特征。

關(guān)鍵詞：高烏甲素；殼聚糖納米粒；體外釋藥；微乳液-離子交聯(lián)法；正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

KEY W 0RDS：1appaconitine；chitosan nanopartic1es；re1ease in vitro；microemu1sion-ionic cross1inkingmethod；orthogona1design test

高烏甲素是從毛茛科植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根中提取出的一種生物堿，是我國首創(chuàng)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥。研究表明，其鎮(zhèn)痛效果與哌替啶相當(dāng)，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度是氨基比林的7倍，無致畸、致突變作用，也不產(chǎn)生耐藥性和蓄積中毒，被廣泛用于癌痛和術(shù)后鎮(zhèn)痛，另外還具有抗炎消腫、抗心律失常以及抗腫瘤等一些藥理作用［1-4］。臨床上出現(xiàn)持續(xù)、頑固性疼痛的患者，需要長期使用鎮(zhèn)痛劑；心律失常、心肌梗死、高血壓等疾病的發(fā)作存在明顯的周期性節(jié)律變化，需提前服藥，以預(yù)防和控制疾?。?］。目前，臨床上使用的高烏甲素制劑（主要有氫溴酸高烏甲素片劑和注射劑）存在的主要問題是使用劑量偏低［6-7］，半衰期短，對重度疼痛效果不佳，導(dǎo)致給藥頻繁，患者順應(yīng)性差，并且氫溴酸高烏甲素和高烏甲素的分子結(jié)構(gòu)中含有酰胺鍵和酯鍵，對光不穩(wěn)定［8］。為減少給藥次數(shù)，提高高烏甲素的穩(wěn)定性和患者的順應(yīng)性，發(fā)揮穩(wěn)定持久的治療效果，有必要開發(fā)載高烏甲素生物可降解緩釋制劑，以滿足臨床不同的需求。

納米粒作為控制釋放藥物的體系，既能增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，提高藥物療效，降低其毒副作用，又可越過許多生物屏障和組織間隙，有效地到達(dá)病灶部位，從而對藥物進(jìn)行更有效地靶向輸送以及控制釋放［9］。殼聚糖是一種安全可靠的堿性天然生物活性多糖，具有來源豐富、生物相容性好、生物可降解和分解產(chǎn)物無毒性等優(yōu)點(diǎn)，已成為廣泛應(yīng)用的新型藥用輔料之一，作為微球、微囊、納米粒等藥物載體的研究也日益受到重視［10-12］。而且，其粒徑小，表面積大，與生物膜有較高的黏著性，因此可以通過腸Peyer’s斑的吸收來提高所載藥物的生物利用度［13-14］。

殼聚糖納米粒的制備方法有共價(jià)交聯(lián)法、沉淀析出法、離子誘導(dǎo)法以及自組裝法等［15-17］。本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖為載體材料，采用微乳液-離子交聯(lián)法，以對細(xì)胞無毒副作用的三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，制備載高烏甲素殼聚糖納米粒，以保證高烏甲素在體內(nèi)的穩(wěn)定釋放，達(dá)到緩釋的效果，為相關(guān)新制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lab Tech紫外-可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；JIA-6數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；CT15IT離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；MCI 301原子力顯微鏡（德國Bruker公司）；LGJ-18S冷凍干燥機(jī)（北京松原華興科技發(fā)展有限公司）；Zetasizer 70馬爾文激光粒度儀（馬爾文儀器有限公司）；SHA-C恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；MD44透析袋（北京索萊寶科技有限公司，批號20120415）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1.2 試藥 高烏甲素（甘肅新蘭藥藥業(yè)有限公司，批號20080301，純度＞98.2%）；殼聚糖（山東奧康科技有限公司，批號20121201，脫乙酰度91%，Mw＝360 kDa）。三聚磷酸鈉為分析純（天津市博迪化工有限公司，批號20110301）；冰乙酸為分析純（西安化學(xué)試劑廠，批號20120803）；液體石蠟為分析純（上海中秦化學(xué)試劑有限公司，批號20121015）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒的制備 參考文獻(xiàn)［18］，精密稱取

高烏甲素15 mg，溶于5 mL 2%殼聚糖冰醋酸溶液中，作為水相；取液體石蠟適量，作為油相。將25 mL液體石蠟和400 mg表面活性劑Span-80加入三口燒瓶內(nèi)，55℃恒溫水浴中600 r/min攪拌混合均勻，在800 r/min恒速攪拌下將水相逐滴加入到油相中，形成均勻的微乳液。攪拌30 min后，緩慢滴加4 mL 15%三聚磷酸鈉，繼續(xù)攪拌30 min后，4℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用無水乙醚洗滌數(shù)次，超純水超聲分散，冷凍干燥，得到納米粒的凍干粉。不加高烏甲素，同法制備殼聚糖的空白樣品。

2.2 檢測波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 檢測波長的選擇 精密稱取高烏甲素和殼聚糖各10 mg，0.1 mo1/L鹽酸溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的溶液，過濾，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。由圖可知，高烏甲素在298 nm處有最大吸收，并且殼聚糖不影響高烏甲素的含有量測定，故選擇298 nm作為高烏甲素的檢測波長。

圖1 高烏甲素和殼聚糖的紫外圖譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of lappaconitine and chitosan

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與回歸方程的建立 精密量取0.2 mg/mL的高烏甲素貯備液1、2、3、4、5、6、7 mL，置于10 mL量瓶中，0.1 mo1/L鹽酸定容。以0.1 mo1/L鹽酸為空白對照，在298 nm波長處用紫外-可見分光光度計(jì)測定各質(zhì)量濃度，高烏甲素溶液的吸光度（A），以其對高烏甲素的質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝0.269 36 C＋0.000 20，r＝0.999 32（n＝7）。結(jié)果表明，高烏甲素在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3 包封產(chǎn)率和載藥量的測定 精密稱取納米粒凍干品適量，0.1 mo1/L HC1溶解，超聲提取15 min，離心分離，取上清液。重復(fù)操作3次，合并上清液，定容至50 mL量瓶中，在298 nm波長處測定吸光度（A），依下式計(jì)算高烏甲素的包封產(chǎn)率和載藥量。

2.4 單因素試驗(yàn)考察納米粒的制備工藝

2.4.1 乳化轉(zhuǎn)速的影響 固定高烏甲素和殼聚糖的質(zhì)量比，水相和油相的體積比、Span-80的用量、三聚磷酸鈉的濃度以及其他工藝參數(shù)不變，設(shè)定乳化轉(zhuǎn)速分別為600、700、800、900、1 000 r/min，考察其對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著乳化轉(zhuǎn)速的增加，納米粒的包封產(chǎn)率和載藥量先增加后減少，當(dāng)轉(zhuǎn)速為800 r/min時(shí)達(dá)到最大，而且納米粒圓整，黏連程度較低。

圖2 乳化轉(zhuǎn)速對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響（n＝3，±s）Fig.2 Effects of emulsification rotation speed on nanoparticles’encapsulation yield and drug loading rate（n＝3，±s）

2.4.2 Span-80用量的影響 固定高烏甲素和殼聚糖的質(zhì)量比，水相和油相的體積比、乳化轉(zhuǎn)速、三聚磷酸鈉的濃度以及其他工藝參數(shù)不變，設(shè)定Span-80的用量分別為100、200、300、400、500 mg，考察其對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響，結(jié)果見圖3。由圖可知，當(dāng)Span-80用量為400 mg時(shí)，納米粒的包封產(chǎn)率和載藥量最大，故在正交試驗(yàn)中將Span-80的用量設(shè)定為400 mg。

圖3 Span-80用量對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響（n＝3，±s）Fig.3 Effects of Span-80 dosage on nanoparticles’encapsulation yield and drug loading rate（n＝3，±s）

2.4.3 三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 固定高烏甲素和殼聚糖的質(zhì)量比，水相和油相的體積比、乳化轉(zhuǎn)速、Span-80用量以及其他工藝參數(shù)不變，設(shè)定三聚磷酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%，考察其對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響，結(jié)果見圖4。由圖可知，當(dāng)三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，納米粒的包封產(chǎn)率和載藥量最大，成球性較好，黏連程度較低，故在正交試驗(yàn)中將三聚磷酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為15%。

圖4 三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響（n＝3，±s）Fig.4 Effects of tripolyphosphate concentration on nanoparticles’encapsu lation yield and drug loading rate（n＝3，±s）

2.4.4 液體石蠟用量的影響 固定高烏甲素和殼聚糖的質(zhì)量比，乳化轉(zhuǎn)速、Span-80用量、三聚磷酸鈉用量以及其他工藝參數(shù)不變，設(shè)定液體石蠟用量分別為15、20、25、30、35 mL，考察其對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響，結(jié)果見圖5。由圖可知，當(dāng)液體石蠟用量為20、25、30 mL時(shí)，納米粒的包封產(chǎn)率和載藥量較大，以此進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化制備工藝。

圖5 液體石蠟用量對納米粒包封產(chǎn)率和載藥量的影響（n＝3，±s）Fig.5 Effects of liquid paraffin dosage on nanoparticles’encapsulation yield and drug loading rate（n＝3，±s）

2.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化納米粒的制備工藝

2.5.1 因素水平的確定 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對納米粒形態(tài)和質(zhì)量影響較顯著的乳化轉(zhuǎn)速（A）、Span-80用量（B）、三聚磷酸鈉用量（C）和液體石蠟用量（D）4個(gè)因素作為考察對象，以包封產(chǎn)率為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化納米粒的制備工藝參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal design test

2.5.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 制備納米粒的正交試驗(yàn)安排與結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可知，各因素對納米粒包封產(chǎn)率的影響程度依次為B＞A＞C＞D，最佳水平為A2B2C2D2；由表3可知，Span-80用量對納米粒的包封產(chǎn)率有非常顯著的影響，乳化轉(zhuǎn)速和三聚磷酸鈉用量有顯著影響，而液體石蠟用量影響不顯著。綜合考慮，制備納米粒的最佳工藝參數(shù)為乳化轉(zhuǎn)速800 r/min，Span-80用量400 mg，三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，液體石蠟用量25 mL。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)所得的最佳制備工藝參數(shù)，平行制備3批納米粒，并對其包封產(chǎn)率、載藥量、形態(tài)、粒徑及分布進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，優(yōu)化工藝條件下制備的納米粒平均包封產(chǎn)率為（35.34±0.94）%，載藥量為（2.25±0.08）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.65%、3.73%。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of orthogonal design tests（n＝3）

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.6 納米粒的粒徑及其分布 采用馬爾文激光粒度儀，測定納米粒的粒徑及其分布。再稱取一定量的納米粒，去離子水將其超聲分散后放于樣品池，于25℃下測定，結(jié)果見圖6。

圖6 納米粒的粒徑分布Fig.6 Nanoparticles’size distribution

粒徑大小及其分布是評價(jià)納米粒質(zhì)量的有效指標(biāo)，也是其基本特征之一［19］。由圖可知，納米粒的平均粒徑為334 nm，多分散系數(shù)為0.223，Zeta電位為10 mV，即表面帶正電荷，這是殼聚糖-NH2基離子化的結(jié)果。由于靜電斥力的作用，有利于其在較長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存在。

2.7 形態(tài)學(xué)研究 取納米粒適量，去離子水稀釋并超聲分散后，采用滴加沉積法滴在云母片表面，旋涂法制樣。室溫干燥后，原子力顯微鏡掃描其形態(tài)。掃描管為J掃描管，探針為標(biāo)準(zhǔn)Si探針，所得圖像在Tapping模式下獲得。結(jié)果見圖7。

圖7 納米粒表面形貌圖（2 000 nm×2 000 nm）Fig.7 Nanoparticles’surface image（2 000 nm×2 000 nm）

由圖可知，采用微乳液-離子交聯(lián)法制備的納米粒大小均勻，外觀較圓整，基本呈球形或類球形，而且其分散性良好，無黏連現(xiàn)象。

2.8 體外釋藥特性研究 采用動(dòng)態(tài)透析法［20］，稱取納米粒及高烏甲素原料藥適量，用少量磷酸鹽緩沖液（pH＝7.4）稀釋成混懸液，分別放入處理好的透析袋中，扎緊兩端，投入含50 mL緩沖液的錐形瓶中，在（37±0.5）℃、100 r/min的恒溫水浴振蕩器中振搖，分別于10、20、30 min和1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、10、20、24、28、30 h取出3 mL釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充同體積、同溫度的新鮮溶出介質(zhì)。0.45 μm微孔濾膜過濾后，檢測釋放介質(zhì)中高烏甲素的含有量，并計(jì)算累積釋放率，繪制納米粒體外釋藥曲線，結(jié)果見圖8。

圖8 納米粒的釋藥曲線Fig.8 Nanoparticles’release curve

由圖可知，緩沖液中游離的高烏甲素釋放較快，約8 h即可完全釋出，而納米粒持續(xù)緩慢釋放，8 h的累積釋放量為60%，而30 h達(dá)到70%左右。結(jié)果表明，納米粒具有連續(xù)的釋放特性，并且達(dá)到明顯的緩釋效果。

3 討論

高烏甲素及其氫溴酸衍生物是一種非成癮性鎮(zhèn)痛藥，被推薦為“癌癥病人三階梯止痛療法”藥物，但由于其水溶性低，光化學(xué)敏感，半衰期短，患者順應(yīng)性差，導(dǎo)致對重度疼痛的鎮(zhèn)痛效果不佳。針對該缺陷，眾多學(xué)者對高烏甲素中的N原子進(jìn)行修飾，并對酯鍵進(jìn)行了改造［21］，合成了能提高水溶性和鎮(zhèn)痛效果的衍生物［22］。通過新型載藥系統(tǒng)，如包合物［23］、脈沖釋放片［24］、固體脂質(zhì)體納米粒［25］、亞微球［26］、納米囊［27］、水凝膠［28］等形式來傳遞藥物，在一定程度上提高了高烏甲素的作用療效，并且降低了其毒副作用。

本實(shí)驗(yàn)采用的殼聚糖是一種陽離子聚電解質(zhì)，具有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、抗酸、抗?jié)?、降脂和降低膽固醇的作用，可阻止或減弱藥物對胃的刺激，直接抑制腫瘤細(xì)胞，并通過活化免疫系統(tǒng)來顯示抗癌活性［29-30］，以其為載體材料制備的納米粒能提高藥物的穩(wěn)定性，增加藥物的吸收，并且可以達(dá)到緩釋及靶向的作用［31］，故已成為藥物新劑型研究的熱點(diǎn)。以微乳液-離子交聯(lián)法制備的納米粒平均包封產(chǎn)率（35.34±0.94）%，平均載藥量（2.25±0.08）%，平均粒徑334 nm，多分散系數(shù)0.223，Zeta電位10 mV，體外可持續(xù)緩慢釋放，30 h的累積釋放量接近70%，具有連續(xù)的釋放特性和明顯的緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳化轉(zhuǎn)速、Span-80用量、三聚磷酸鈉用量、液體石蠟用量等因素對納米粒的包封產(chǎn)率、載藥量以及形態(tài)均有一定的影響。適當(dāng)?shù)娜榛瘮嚢杷俣扔欣谛纬筛甙猱a(chǎn)率和載藥量的納米粒，而攪拌速度大于800 r/min時(shí)，由于剪切力的增大，可能破壞了殼聚糖的分子鏈骨架［32］，納米粒粒徑過小，導(dǎo)致包封產(chǎn)率和載藥量的下降。乳化劑Span-80對納米粒的形態(tài)和粒徑影響較大，劑量不足，會(huì)導(dǎo)致納米粒聚集，粒徑分布變寬，形狀不規(guī)則；劑量過大，Span-80在降低納米粒粒徑的同時(shí)也降低了高烏甲素的包封產(chǎn)率和載藥量。殼聚糖的用量一定時(shí)，較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉難以使其完全交聯(lián)，形成納米粒，這可能是由于三聚磷酸鈉用量相對不足、殼聚糖的黏度較大，鏈的纏繞妨礙了分子間的交聯(lián)成球［33］，高烏甲素的包封產(chǎn)率和載藥量相對較低；濃度過大，則大量的殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)，導(dǎo)致納米粒團(tuán)聚，粒徑增大。液體石蠟用量過小時(shí)，納米粒的形態(tài)較差，粒徑較大；用量過大時(shí)，粒徑變小，導(dǎo)致包封產(chǎn)率和載藥量降低。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了納米粒的制備工藝。其最佳工藝參數(shù)為乳化轉(zhuǎn)速800 r/min，Span-80用量400 mg，三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，液體石蠟用量25 mL。該工藝簡便可靠，反應(yīng)條件溫和，交聯(lián)劑三聚磷酸鈉避免了對細(xì)胞可能造成的毒副作用，為脂溶性藥物高烏甲素的給藥提供了新途徑。

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Preparation of chitosan nanoparticles loaded With lappaconitine and their characteristics of in vitro release

MA Jun-yi1，2， CHEN Xiang-1ing1， SHENG Ai-xia1， SONG Li-ping1， ZHANG Ji1，2

（I.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 73OO7O，China；2.Gansu Engineering and Technology Research Center for Effective& Featured Component Products from Local Plants，Lanzhou 73OO7O，China）

ABSTRACT：AIM To prepare chitosan nanopartic1es 1oaded with 1appaconitine and to investigate their characteristics of in vitro re1ease.METH0DS The nanopartic1es were prepared by microemu1sion-ionic cross1inking method，with chitosan as the carriermateria1and tripo1yphosphate as the cross1inker.The encapsu1ation yie1d and drug 1oading rate were taken asmain eva1uation indices for optimizing the preparation process by orthogona1design test.RESULTS At amean partic1e size of 334 nm，the nanopartic1es showing spherica1or spheroida1 shape remained stab1e within 30 h.The encapsu1ation yie1d and drug 1oading rate of 1appaconitine were（35.34±0.94）% and（2.25±0.08）%，respective1y.C0NCLUSI0 N The nanopartic1es prepared by this simp1e and re1iab1e techno1ogy can achieve obvious sustained re1ease.

作者簡介：馬君義（1967—），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事藥物新劑型與新技術(shù)、資源植物化學(xué)、生物高分子研究。Te1：（0931）7975153，E-mai1：skymjy@nwnu.edu.cn

基金項(xiàng)目：蘭州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012-2-92）

收稿日期：2015-08-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.012

中圖分類號：I944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0533-06