羅 書， 李燕舞， 巫燕莉， 杜 群（廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405）

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補中益氣丸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜mRNA表達(dá)的影響

羅 書， 李燕舞*， 巫燕莉， 杜 群
（廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405）

摘要：目的 研究補中益氣丸（黃芪、白術(shù)、陳皮等）對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠結(jié)腸黏膜NOD樣受體蛋白3（Nlrp3）、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白（Asc）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-I）m INA表達(dá)的影響，評估其對UC的預(yù)防作用。方法 將60只C57BL/6小鼠隨機分為空白組，模型組，柳氮磺砒啶（SASP）對照組，補中益氣丸高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組予3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）造模；正常組、模型組每日給予蒸餾水0.01 mL/g；陽性對照組每日給予柳氮磺砒啶1.33 g/kg；補中益氣丸高、中、低劑量組每日分別給予補中益氣丸12、6、3 g/kg，連續(xù)給藥7 d后，提取結(jié)腸樣本，觀察小鼠結(jié)腸病理變化，實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測結(jié)腸粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)水平。結(jié)果 模型組小鼠病理檢測顯示結(jié)腸上皮糜爛、出血、多病灶淺潰瘍、大量炎細(xì)胞浸潤，而給藥組均不同程度地改善上述癥狀。與空白組、柳氮磺砒啶對照組比較，模型組Nlrp3表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與補中益氣丸各組比較，沒有明顯差異（P＞0.05）；與其它各組比較，模型組Asc、caspase-I m INA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論 補中益氣丸對DSS誘導(dǎo)小鼠UC有一定預(yù)防作用，其雖未能抑制Nlrp3表達(dá)，卻能明顯抑制Asc、caspase-I表達(dá)，提示其對小鼠UC預(yù)防作用機制可能與抑制結(jié)腸黏膜Asc、caspase-I表達(dá)，阻斷Nlrp3炎性體裝配有關(guān)。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；補中益氣丸；NOD樣受體蛋白3；凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1

KEY W 0RDS：u1cerative co1itis；Buzhong Yiqi Pi11s；NOD-1ike receptor protein 3（Nlrp3）；apoptosis-associated speck-1ike proteincontaining CAID（Asc）；cysteiny1aspartate specific proteinase-1（caspase-I）

炎癥性腸病是一組病因和發(fā)病機制不明的慢性腸道非特異性疾病，其病變位于大腸，呈連續(xù)性彌漫分布，多數(shù)累及直腸和乙狀結(jié)腸。潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸病的一種，其典型臨床癥狀包括黏液膿血便和腹痛腹瀉［1］。由于本病病因及發(fā)病機制尚未明確，且難治愈，易復(fù)發(fā)，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治?。?］。葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠UC模型是目前應(yīng)用最為廣泛的模型之一，具有造模簡便、價格便宜、成功率較高等特點，且臨床表現(xiàn)、病變部位、病理學(xué)表現(xiàn)與人類UC極其相似，因此在相關(guān)研究中占有重要地位［3］。

NLIP3炎性小體由NLIP3（NOD樣受體蛋白3）、ASC（凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白）和caspase-1（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1）組成。NLIP3炎性小體在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，其激活是一把雙刃劍。一方面，腸腔病原體及其代謝產(chǎn)物等不良因素可以激活NLIP3炎性體，激發(fā)腸道固有免疫發(fā)揮屏障防御作用；另一方面，炎性體的激活可導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族炎性因子分泌過多，加重腸黏膜炎癥反應(yīng)造成腸道損傷［4］。

補中益氣丸由黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸、生姜、大棗組成，具有補中益氣，升陽舉陷之功效。李日光［5］以補中益氣丸聯(lián)合柳氮磺吡啶（SASP）治療40例UC患者，總有效率達(dá)90%，療效顯著，證明補中益氣丸對UC具有確定的療效。本實驗通過DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型，以NLIP3炎性小體為切入點，探討補中益氣丸對UC的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，雌性，體質(zhì)量

18～22 g，動物合格證編號44007200014518，由廣東省實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 DSS（分子量為36 000～50 000）由廣州市紅爍林生物科技有限公司提供；SASP由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，批號20130915；補中益氣丸由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，批號Z11020244；INAiso P1us（貨號9108）、5×PrimeScript IT Master Mix（貨號I I 036A）、SYBI Premix Ex Taq II（貨號G0668）均由寶生物工程（大連）有限公司提供。

1.3 儀器 3K30/V低溫高速離心機（美國Sigma公司）；D-8721 PCI儀（日本Takara公司）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo公司）；PTC-220熒光定量PCI儀（美國Bio-Iad公司）。

1.4 分組與造模 將60只C57BL/6小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性藥物對照組，補中益氣丸高、中、低劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組予3% DSS水溶液代替飲用水1周，隔天更換新鮮DSS水溶液。

1.5 給藥 研磨SASP片和補中益氣丸，制成溶液，于造模同時給藥，連續(xù)7 d?？瞻捉M和模型組每日給予蒸餾水0.01 mL/g；陽性藥物對照組每日給予SASP 1.33 g/kg，按成人等效劑量換算；補中益氣丸高、中、低劑量組每日分別給予補中益氣丸12、6、3 g/kg，分別按成人有效劑量40、20、10倍換算。

1.6 取樣 麻醉處死小鼠，剪取肛門至回盲部的整段結(jié)腸，測量長度，沿腸系膜邊緣縱向剖開，清理內(nèi)容物，用預(yù)冷生理鹽水清洗，濾紙除去多余水分，稱取結(jié)腸總質(zhì)量，計算單位結(jié)腸質(zhì)量（單位結(jié)腸質(zhì)量＝結(jié)腸總質(zhì)量/結(jié)腸長度）。

1.7 病理組織觀察 截取中段結(jié)腸0.5 cm，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察黏膜完整性、黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤及腸腺體改變。

1.8 結(jié)腸黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)

1.8.1 提取總INA 取結(jié)腸樣本100 mg，加入1 mL INAiso P1us，冰上充分研磨，室溫靜置5 min，12 000×g，4℃，離心5 min；取上清于新離心管中，加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min，12 000×g，4℃，離心15 min；取上清于新離心管中，加入同體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12 000×g，4℃，離心10 min；棄上清保留沉淀，加入1 mL 75%酒精，反復(fù)吹打，12 000×g，4℃，離心5min；棄上清，保留沉淀，待酒精揮發(fā)后，加入50 μL去離子水，溶解沉淀，-20℃保存。

1.8.2 引物合成 查閱文獻(xiàn)，確定Nlrp3、Asc、caspase-I的引物，以Gapdh為內(nèi)參，引物核苷酸序列見表1，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 qPCR Primer sequences

1.8.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照5×PrimeScript IT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s，4℃終止。

1.8.4 qPCI反應(yīng) 參照SYBI Premix Ex TaqⅡ熒光物質(zhì)試劑盒說明操作。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，39個循環(huán)后72℃延伸7 min。

1.8.5 qPCI結(jié)果 采用2-△△Ct法，以模型組小鼠結(jié)腸m INA表達(dá)為參照，對結(jié)果行相對定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以±s進(jìn)行表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠結(jié)腸長度及結(jié)腸質(zhì)量結(jié)果 由表2可見，與空白組比較，模型組結(jié)腸長度縮短（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、補中益氣丸低劑量組結(jié)腸長度增長（P＜0.05），補中益氣丸高、中劑量組結(jié)腸長度無明顯差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組結(jié)腸質(zhì)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，用藥組結(jié)腸質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05），但有下降的趨勢。

表2 結(jié)腸長度和質(zhì)量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

表2 結(jié)腸長度和質(zhì)量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　結(jié)腸長度/cm單位結(jié)腸質(zhì)量/（g·cm-1）空白組6.46±0.32　0.022±0.003模型組　4.88±0.56*　0.031±0.003*陽性對照組　6.00±0.35△　0.029±0.003補中益氣丸高劑量組　5.06±0.56　0.030±0.004補中益氣丸中劑量組　5.58±0.18　0.029±0.002補中益氣丸低劑量組　6.08±0.41△0.029±0.002

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 HE染色顯示（圖1），空白組小鼠結(jié)腸未見明顯病理變化；模型組小鼠結(jié)腸腺體全部消失，黏膜水腫，黏膜下大量炎細(xì)胞浸潤；陽性對照組及補中益氣丸高、中、低劑量組均見腺體大部分消失，黏膜不同程度的水腫，黏膜下大量炎細(xì)胞浸潤。

2.3 結(jié)腸粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)結(jié)果 由表3可見，與空白組比較，模型組Nlrp3表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組表達(dá)減少（P＜0.05），補中益氣丸高、中、低劑量組表達(dá)均無明顯差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組Asc表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、補中益氣丸組表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。與空白組比較，模型組caspase-I表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和補中益氣丸高、中劑量組表達(dá)顯著減少（P＜0.05），但補中益氣丸低劑量組無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

UC是原因不明的累及全腸的非特異性炎癥，以腹瀉、黏液血便、腹痛、里急后重為主要特征，并伴有乏力、消瘦、飲食欲下降等全身癥狀。屬于中醫(yī)“痢疾”、“滯下”、“腸風(fēng)”、“泄瀉”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，該病病機是本虛標(biāo)實，虛實夾雜。本虛責(zé)之于脾，因此，防治UC當(dāng)以益氣健脾入手。史柯［6］以益氣健脾法治療41例UC患者，總有效率達(dá)92.7%，體現(xiàn)了益氣健脾法在UC防治上的作用。補中益氣丸是健脾益氣的經(jīng)典方，由黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸、生姜、大棗組成，臨床將之用于治療UC取得較好療效。

圖1 補中益氣丸對UC模型小鼠結(jié)腸組織病理組織學(xué)的影響（HE，×100）Fig.1 Effect of BZYQ colon histopathology in m iceWith ulcerative colitis（HE，×100）

表3 結(jié)腸黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表達(dá)量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

表3 結(jié)腸黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表達(dá)量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別Nlrp3　Asc　caspase-I空白組0.177±0.029 0.246±0.035　 0.234±0.028模型組　0.943±0.079*0.967±0.090*0.984±0.124*陽性對照組　0.456±0.049△0.369±0.105△0.439±0.061△補中益氣丸高劑量組　0.804±0.077 0.378±0.086△0.567±0.069△補中益氣丸中劑量組　0.801±0.089 0.422±0.064△0.447±0.063△補中益氣丸低劑量組　0.868±0.131 0.618±0.090△0.863±0.102

DSS是由蔗糖合成的一種硫酸多糖體，能誘發(fā)UC。王顯飛等［7］通過實驗證實單個循環(huán)飲用3% DSS可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生與人類臨床和病理表現(xiàn)相似的結(jié)腸炎。該模型制作簡便、經(jīng)濟，重復(fù)性好，可用于UC發(fā)病機制、病理變化和藥物療效評估的研究，應(yīng)用廣泛［8］。

NLIP3是NOD樣受體家族的主要成員，近年研究表明其參與維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定，并與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［9］。NLIP3炎性小體由NLIP3、ASC和caspase-I組成。NLIP3的激活可致其熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrindomain，PYD）與ASC 的PYD連接，致ASC的胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CAID）與caspase-I 的CAID結(jié)合，完成NLIP3炎性體的裝配從而活化caspase-I進(jìn)而參與腸道免疫反應(yīng)［10］。Bauer等［11-12］研究表明，DSS可通過NLIP3炎性體的裝配，激活caspase-I從而誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥損傷，NLIP3基因敲除以及對caspase-I藥理抑制可有效減輕DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癥狀。Wu等［13］研究表明，抑制NLIP3炎性體的激活可能是治療炎癥性腸病（inf1ammatory bowe1 disease，IBD）的途徑。但Zaki等［14］卻認(rèn)為，腸道NLIP3基因缺陷可以導(dǎo)致腸粘膜屏障通透性增強，誘導(dǎo)有害免疫反應(yīng)，進(jìn)而加重IBD過程中腸粘膜損傷。

本研究采用3% DSS誘導(dǎo)小鼠UC，同時給予補中益氣丸高、中、低劑量和SASP進(jìn)行預(yù)防干預(yù)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSS飲水可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠出現(xiàn)黏液血便、消瘦以及腸黏膜的急性炎癥損傷，補中益氣丸高、中、低劑量及SASP均能在不同程度上改善DSS模型組小鼠的結(jié)腸損傷程度及小鼠生存狀態(tài)。針對NLIP3炎性體進(jìn)一步研究顯示，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表達(dá)均顯著增高，提示炎性體的激活可能是DSS誘導(dǎo)腸黏膜損傷的直接因素。同時，益氣健脾復(fù)方及臨床常用抗炎藥物SASP預(yù)防給藥對NLIP3炎性體復(fù)合物的基因表達(dá)均有顯著的抑制作用。其中補中益氣丸能顯著抑制Asc和caspase-I的m INA表達(dá)，SASP則對Nlrp3、Asc、caspase-I的表達(dá)均明顯抑制?？梢姡A(yù)防給予抗炎或益氣健脾復(fù)方，可在不同程度加強腸黏膜的抗損傷能力，其作用機制可能與抑制Asc的表達(dá)，阻斷Nlrp3炎性體的裝配，阻止caspase-I活化有關(guān)。研究為臨床UC預(yù)防治療及緩解期用藥提供了實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 關(guān)麗華，龔玉芳，張 弘，等.結(jié)腸康對惡唑酮誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎MPO、NO、iNOS的影響［J］.中成藥，2013，35（4）：669-673.

［2］ 王新月，王建云.潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)藥治療的關(guān)鍵問題與優(yōu)勢對策［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：263-267.

［3］ 農(nóng) 輝，黃 雪.葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2014，22（22）：3245-3250.

［4］ Kim J J，Jo E K.NLIP3 inf1ammasome and host protection against bacteria1 infection［J］.J Korean Med Sci，2013，28 （10）：1415-1423.

［5］ 李日光.補中益氣丸治療潰瘍性結(jié)腸炎80例臨床觀察［J］.中國實用醫(yī)藥，2012，7（7）：172-173.

［6］ 史 柯.中醫(yī)健脾益氣法治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效觀察［J］.光明中醫(yī)，2014，29（9）：1873-1874.

［7］ 王顯飛，陳 燁，陳村龍，等.急性結(jié)腸炎慢性化小鼠模型的建立［J］.胃腸病學(xué)，2008，13（3）：167-170.

［8］ 祁向爭，劉 潔.潰瘍性結(jié)腸炎動物模型研究進(jìn)展［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，29（4）：220-222.

［9］ Zambetti L P，Morte11aro A.NLIPs，microbiota，and gut homeostasis：unrave11ing the connection［J］.J Pathol，2014，233（4）：321-330.

［10］ 原 孟，尚麗新.NLIP1和NLIP3炎性體的研究進(jìn)展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（23）：10894-10897.

［11］ Bauer C，Duewe11P，Lehr H A，etal.Protective and aggravating effects of N1rp3 inf1ammasome activation in IBDmode1s：inf1uence of genetic and environmenta1 factors［J］.Dig Dis，2012，30（Supp11）：S82-S90.

［12］ Bauer C，Duewe11P，Mayer C，et al.Co1itis induced in mice with dextran su1fate sodium（DSS）ismediated by the NLIP3 inf1ammasome［J］.Gut，2010，59（9）：1192-1199.

［13］ Wu X F，Ouyang Z J，F(xiàn)eng L L，et al.Suppression of NF-κB signa1ing and NLIP3 inf1ammasome activation in macrophages is responsib1e for the ame1ioration of experimenta1murine co1itisby the natura1compound fraxine11one［J］.Toχicol Appl Pharmacol，2014，281（1）：146-156.

［14］ ZakiM H，LamkanfiM，Kanneganti TD.The N1rp3 inf1ammasome：contributions to intestina1 homeostasis［J］.Trends Immunol，2011，32（4）：171-179.

Effect of Buzhong Yiqi Pills on m RNA expression in colonic mucosal of m ice With ulcerative colitis

LUO Shu， LIYan-wu*， WU Yan-1i， DU Qun

（Institute of Spleen and Stomach，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 5IO4O5，China）

ABSTRACT：AIM To exp1ore the effects of Buzhong Yiqi Pi11s（Astragalusmembransaceus，Atractylodesmacrocephala，Citrus reticulatea，etc.）on Nlrp3，Asc and caspase-I expressions in co1onicmucosa1ofmice with u1cerative co1itis and to eva1uate its preventive effects against u1cerative co1itis.METH0 DS Sixty C57BL/6 micewere random1y divided into the norma1 group，mode1 group，positive contro1 group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups，with ten mice in each group.Mice in themode1group，positive contro1group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groupswere treated with 3% DSS.Mice in the positive contro1group were treated with 1.33 g/kg SASP，mice in the Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups were treated with 12 g/kg，6 g/kg and 3 g/kg Buzhong Yiqi Pi11s，respective1y，and mice in the norma1group and mode1group were treated with 0.01 mL/g disti11ed water.A11 the groupswere treated for seven consecutive days.After seven days，the patho1ogica1 changes in co1onic mucosa1ofmice were observed.Meanwhi1e，m INA expressions of Nlrp3，Ascbook=486,ebook=20and caspase-I were detected by IT-qPCI ana1ysis.RESULTS Compared with the norma1 group，the mode1 group’s patho1ogica1examination showed co1on epithe1ia1 erosion，b1eeding，mu1tifoca1 u1cers and numerous inf1ammation ce11s infi1trating.However，the symptomswere improved in other groups.The expression of Nlrp3 m INA in themode1group was obvious1y higher than that in the norma1group and positive contro1group（P＜0.05），which was not different from a11 the Buzhong Yiqi Pi11s groups（P＞0.05）.The expressions of Asc and caspase-I m INA in the mode1group were obvious1y higher than those in another groups（P＜0.05）.C0NCLUSI0N Buzhong Yiqi Pi11s show certain preventive effects against DSS-induced u1cerative in mice.They do not inhibit the expression of Nlrp3，but inhibit the expressions of Asc and caspase-I.Themechanism of preventing the u1cerative co1itis in micemay be re1ated to the inhibition of Asc m INA and caspase-I m INA expressions to b1ock the formation of Nlrp3 inf1ammasome.

*通信作者：李燕舞（1976—），女，博士，副研究員，從事胃腸黏膜損傷及中藥復(fù)方的防治機制研究。Te1：（020）36585555，E-mai1：1yw_ 7614@126.com

作者簡介：羅 書（1988—），男，碩士生，從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。Te1：18819324404，E-mai1：1uoshu088323@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81202627）；華南中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心-中醫(yī)藥防治脾胃病、腦病創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目（A1-AFD01514A05）

收稿日期：2015-10-16

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.003

中圖分類號：I285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0485-05