肖婷，吳志雄，羅健，李芳，曾歐，楊軍

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硫化氫對糖尿病大鼠心肌膠原重構的影響及其機制探討

肖婷，吳志雄，羅健，李芳，曾歐，楊軍

摘要

關鍵詞糖尿病;硫化氫；膠原；心肌纖維化

作者單位：421001 湖南省衡陽市，南華大學附屬第一醫(yī)院 心血管內科

Impact and its Mechanism of Hydrogen Sulfide on Myocardial Collagen Remodeling in Experimental Rats With Diabetic Mellitus

XIAO Ting, WU Zhi-xiong, LUO Jian, LI Fang, ZENG Ou, YANG Jun.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of South China University, Hengyang (421001), Hunan, China
Corresponding Author: YANG Jun, Email: yangjunincn@163.com

Abstract

Objective: To investigate the impact and its possible mechanism of hydrogen sulfide (H2S) on myocardial collagen remodeling in experimental rats with diabetic mellitus (DM).

Methods: Rat’s DM model was established by intraperitoneal injection of STZ at 40 mg/kg. A total of 40 SD rats were randomly divided into 4 groups: Control group, DM group, DM + NaHS group, in which NaHS worked as exogenous donor of H2S and NaHS control group. n=10 in each group, all animals were treated for 8 weeks. The cardiac collagen deposition was observed by Masson staining, protein expressions of cardiac collagen types I, III, IV and transforming growth factor β1(TGF-β1), connective tissue growth factor (CTGF) were examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, DM group showed increased protein expressions of cardiac collagen types I and III, up-regulated expressions of TGF-β1and CTGF, P<0.05; while the expressions of collagen type IV were similar between 2 groups. Compared with DM group, DM + NaHS group presented reduced cardiac collagen expression, decreased expression of collagen types I and III, down-regulated expressions of TGF-β1and CTGF, P<0.05; while the expressions of collagen type IV were similar between 2 groups.

Conclusion: H2S may improve the myocardial collagen remodeling in experimental DM rats, the mechanism might be related to the down-regulation of TGF-β1 and CTGF expression.

Key words Diabetic mellitus; Hydrogen sulfide; Collagen; Myocardial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:87.)

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病重要的慢性并發(fā)癥之一，心肌膠原重構是DCM主要的病理改變[1]。心肌膠原重構是一個復雜的病理過程。大量研究表明，轉化生長因子β1（TGF-β1）是參與心肌膠原重構發(fā)生的關鍵細胞因子。而結締組織生長因子（CTGF）被認為是介導TGF-β1導致膠原重構的一個重要介質[2]，參與腎臟、肝臟、肺等多種器官的纖維化過程[3-5]。有研究顯示TGF-β1/CTGF信號通路也參與糖尿病心肌膠原重構的發(fā)生過程[6]。硫化氫（H2S）作為一種氣體信號分子，具有廣泛的生物學效應，其對心血管系統(tǒng)的保護作用受到越來越多關注。有研究報道H2S對心肌細胞缺氧復氧損傷具有一定的保護作用[7]。而H2S對糖尿病心肌膠原重構的作用以及相關機制的研究目前尚少見報道。本實驗采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導建立糖尿病大鼠模型，探討H2S對糖尿病大鼠心肌膠原重構的作用，并通過觀察H2S對TGF-β1和CTGF表達的影響，初步探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

實驗動物與主要試劑：2014-10至2015-05選擇40 只成年雄性SD大鼠，體重（300±20）g，購自長沙動物實驗中心； STZ購自美國MP Biomedicals Company USA；硫氫化鈉（NaHS）作為H2S供體，購自美國Sigma公司；兔源Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1及CTGF一抗、抗兔二抗購自中國博士德公司；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購于中國碧云天公司。

動物分組及處理方案：將SD大鼠隨機分4組：對照組、糖尿病組（STZ組）、糖尿病硫氫化鈉干預組（STZ+NaHS組）、硫氫化鈉對照組（NaHS組），每組各10只。大鼠禁食12 h后，糖尿病大鼠模型通過單次腹腔注射STZ（40 mg/kg，溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，pH=4.4）建立，非糖尿病大鼠單次腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉。3天后經(jīng)由尾靜脈取血，檢測血糖高于16.7 mmol/L表示糖尿病動物造模成功，用于后續(xù)試驗。STZ+NaHS組和NaHS組大鼠每日腹腔注射NaHS（100 μmol/kg），對照組和STZ組僅注射同等劑量的生理鹽水。第8周末，采用10%水合氯醛（350 mg/kg）行腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔，摘取心臟后用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，取適量組織于甲醛中固定用作石蠟切片，余保存在 -80℃冰箱，用于免疫印跡測定蛋白等。

Masson染色觀察心肌膠原沉積：分別取4組大鼠左心室心肌組織，以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進行Masson染色，心肌膠原纖維呈藍色，于光鏡下觀察。

Western blot檢測心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1和CTGF蛋白含量：取大鼠新鮮左心室組織，提取蛋白后進行蛋白定量；以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉法將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后，以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原一抗、TGF-β1和CTGF一抗（稀釋度均為1:400）37℃孵育1 h后4℃過夜，TBST（由Tris-HCl、NaCl和Tween20配制，pH=7.6）洗膜3次，洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗（稀釋度為1:4000）37℃孵育1 h，同樣用TBST洗膜3次，化學發(fā)光液（BeyoECL Plus）顯色、曝光后掃描，以目的條帶和內參條帶3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的灰度比值分別表示Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1和CTGF一抗蛋白含量表達水平。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

4組大鼠心肌組織Masson染色結果（圖1）：圖中心肌細胞間藍色染色即為膠原纖維。從圖中可見STZ組大鼠心肌排列紊亂，細胞間藍染膠原纖維明顯增加（如箭頭所示），存在明顯心肌纖維化；而STZ+NaHS組心肌排列紊亂明顯改善，藍染膠原纖維明顯減少，大鼠心肌纖維化較STZ組有所改善。

4組大鼠心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原蛋白表達的比較（圖2):Western blot檢測4組大鼠心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原蛋白表達，與對照組比較，STZ組大鼠心肌組織中的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與STZ組比較，STZ+NaHS組大鼠心肌Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而STZ組大鼠Ⅳ型膠原與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），NaHS組大鼠Ⅳ型膠原與STZ組相比差異亦無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與對照組相比，NaHS組大鼠心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1　4組大鼠心肌組織Masson染色結果（×200）

圖2　Western blot檢測4組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原的表達(n=3)

Western blot檢測4組大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF蛋白的表達（圖3）：與對照組相比，STZ組大鼠心肌組織TGF-β1及CTGF表達水平明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），STZ+NaHS組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF均較STZ組明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。NaHS組大鼠心肌TGF-β1和CTGF蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖3　Western blot檢測4組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF蛋白的表達(n=3)

3　討論

糖尿病心肌病臨床上的早期表現(xiàn)通常為左心室肥厚和舒張功能減退[8]，而其病理改變與心肌膠原重構密切相關[9]。心肌膠原重構是一個膠原沉積和降解的平衡過程，而心肌膠原纖維過度沉積或膠原成分比例的改變可導致心室重構，進而導致心肌僵硬并損害心肌舒張功能。心肌膠原重構是一個復雜的病理過程，眾多機制參與其中，包括炎癥反應、氧化應激及免疫調節(jié)機制等[10, 11]。近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1/CTGF也參與心肌膠原重構的發(fā)生發(fā)展。CTGF是近年發(fā)現(xiàn)的一種致纖維化因子，有增強成纖維細胞活化遷移和合成細胞外基質的能力[12]，并可被TGF-β1在轉錄水平誘導大量表達[13]，且參與多臟器纖維化的發(fā)生。TGF-β1是目前公認的與纖維化發(fā)生密切相關的調控因子。有研究表明，TGF-β1發(fā)揮致纖維化作用需通過上調CTGF的表達。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠與對照組相比，存在明顯心肌纖維化，心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達明顯增多，但Ⅳ型膠原無顯著差異性改變。Ⅳ型膠原與層粘連蛋白一起參與構成細胞外基底膜，反映基底膜膠原的更新率，在某些情況下其含量升高也可以反映心肌纖維化過程[14]。在本實驗中，糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF表達較正常大鼠明顯升高，提示TGF-β1和CTGF可能參與了糖尿病心肌膠原重構的發(fā)生發(fā)展的調控機制。

近年來，大量研究表明，同一氧化氮與一氧化碳一樣，H2S是體內一種重要的細胞信號調控氣體分子。有學者發(fā)現(xiàn)，H2S可改善高血壓大鼠的心肌重構[15]，而其能否改善糖尿病心肌膠原重構目前尚不清楚。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠心肌間質出現(xiàn)明顯膠原沉積，而H2S干預后可使糖尿病大鼠心肌間質膠原纖維顯著減少。且H2S可下調糖尿病大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達，但對Ⅳ型膠原表達無明顯影響，提示H2S可改善糖尿病大鼠的心肌膠原重構。結果還顯示，H2S在改善糖尿病大鼠心肌纖維化的同時也可下調心肌組織TGF-β1和CTGF的表達，而這也可能是H2S改善糖尿病心肌膠原重構的重要信號調控機制。以上結果可為糖尿病心肌膠原重構的發(fā)病機制探討以及研究糖尿病心肌纖維化新的臨床藥物防治策略提供新的思路。

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（編輯：汪碧蓉）

基礎與實驗研究

收稿日期：（2015-04-09）

中圖分類號：R541.6

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）01-0087-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.019

作者簡介：肖婷 碩士研究生 主要從事糖尿病心肌病的研究 Email: 1459593600@qq.com 通訊作者：楊軍 Email: yangjunincn@163.com

基金項目：國家自然科學基金（81202830）；湖南省自然科學基金（11JJ2046）資助項目

目的：探討硫化氫（H2S）對糖尿病大鼠心肌膠原重構的作用及其可能機制。

方法：40只SD大鼠隨機分成4組：對照組、糖尿病組（STZ組）、糖尿病硫氫化鈉（NaHS）干預組（STZ+NaHS組)、NaHS對照組（NaHS組），每組各10只。腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg建立糖尿病模型，以NaHS作為外源性H2S供體。8周后處死大鼠，Masson染色觀察心肌膠原沉積，Western blot 觀察大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、轉化生長因子β1（TGF-β1） 和結締組織生長因子（CTGF）蛋白的表達水平。

結果：與對照組相比，STZ組心肌膠原纖維明顯增多，Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達顯著升高，Ⅳ型膠原無顯著差異性改變，同時TGF-β1及CTGF表達明顯上調（P<0.05）；與STZ組相比，STZ+NaHS組大鼠心肌膠原纖維明顯減少，Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達顯著下降，Ⅳ型膠原無顯著差異性改變，同時TGF-β1及CTGF表達明顯下調（P<0.05）。

結論：H2S可改善糖尿病大鼠心肌膠原重構，其機制可能與其下調TGF-β1及CTGF表達有關。