顧晨，李俊明

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致2型糖尿病缺血心肌易損性增強的機制研究

顧晨，李俊明

摘要

Mechanism of Increased Myocardial Ischemic Vulnerability in Mice Type 2 Diabetes Mellitus Induced by Endoplasmic Reticulum Stress

GU Chen, LI Jun-ming.
Three Gorges University People’s Hospital, Yichang (443002), Hubei, China
Corresponding Author: LI Jun-ming, Email: lijunming@medmail.com.cn

Abstract

Objective: To study the relationship between endoplasmic reticulum stress (ERS) and adiponectin; to explore the role of ERS for increasing myocardial ischemic vulnerability in type 2 diabetes mellitus (DM) mice.

Methods: Type 2 DM model was established by high fat diet with streptozotocin (STZ) injection. A total of 35 C57BL/6J male type 2 DM mice were divided into 4 groups: ①Control group, n=5. ②Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) group, ③Thapsigargin (TG) group and ④Normal saline group. The mice in Groups ②, ③, ④ were fed by high fat and high glucose diet by injecting streptozotocin (STZ), in the last 3 weeks and respectively received intraperitoneal injections of TUDCA (250 mg/kg), thapsigargin (TG) (300 μg/kg) and normal saline twice a day, n=10 in each group. Then myocardial infarction (MI) model was established in 5 mice from each group. 72 hours later, the MI ranges were measured, serum levels of adiponectin were detected, mRNA expressions of adiponectin and CHOP in myocardial tissue were examined.

Results: The MI range in TUDCA group (21.47 ± 2.85) % and in Normal saline group (39.92 ± 4.28) % were both lower than TG group (66.56 ± 8.15) %, both P<0.01. Before MI occurrence, serum levels of adiponectin in TUDCA group (79.25 ± 6.40) pg/ml and in Normal saline group (70.23 ± 4.15) pg/ml were both higher than TG group (62.64 ± 5.70) pg/ml,both P<0.01; serum levels of adiponectin in each group were higher than they were 72 h after MI. In each group, the mRNA expression and protein content of adiponectin in myocardial tissue were constant to serum adiponectin; while the mRNA expression and protein content of CHOP was opposite to serum adiponectin.

Conclusion: ESR could increase myocardial vulnerability in type 2 DM mice which might be related to down-regulating adiponectin expression.

Key words Diabetes mellitus, Type 2; Endoplasmic reticulum; stress; Myocarial ischemia

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:91.)

高血糖和高脂血癥不僅導致血管損傷從而誘發(fā)缺血性心臟病，且直接損害心肌細胞，導致在缺血再灌注后更廣泛的心肌梗死和更嚴重的心力衰竭[1-5]。脂聯(lián)素是一種主要由脂肪組織合成、分泌的脂肪細胞因子，具有調(diào)節(jié)代謝、抗炎及心血管保護作用，血清脂聯(lián)素水平降低能導致心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[6]。多項研究表明糖尿患者血漿脂聯(lián)素水平降低可能是導致缺血性心臟病的關鍵因素[7，8]。脂聯(lián)素通過多個信號通路發(fā)揮其心血管的保護作用[9]。因此，上調(diào)脂聯(lián)素水平能夠減輕糖尿病心肌缺血損傷，但對于脂聯(lián)素的上游調(diào)節(jié)機制仍不是很清楚。缺氧等多種因素導致未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蓄積，致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生改變，統(tǒng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）[10-12]。而?；敲撗跄懰幔═UDCA）是一種緩解ERS的化學分子伴侶，能減輕ERS狀態(tài)下的巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積[13]，毒胡蘿卜內(nèi)酯是一種通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶導致ERS的化學抑制劑。凋亡相關蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）是ERS的一種特征性標志分子。心肌缺血/再灌注損傷（IRI）時，ERS信號通路被激活，分子伴侶以及促凋亡信號分子表達增加[14-16]。TUDCA能降低CHOP的表達即緩解ERS，明顯緩解毒胡蘿卜內(nèi)酯所引起的脂聯(lián)素水平的下調(diào)[17]。

基于上述研究結果，我們提出假設：2 型糖尿病心肌缺血可以引發(fā)ERS，ERS加重可下調(diào)血漿與心肌脂聯(lián)素水平，進而導致缺血心肌易損性增加。

1　材料與方法

實驗動物及分組：SPF級6周齡健康C57BL/6J雄性小鼠35只，購于武 漢 大 學 動 物 實 驗 中 心。小鼠在無特定病原體的環(huán)境中喂養(yǎng)，給予充足飲水，室溫在22～24℃，光照時間（上午8:00起至下午8:00）共12小時照明、12小時黑暗的燈光明暗周期。采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導小鼠發(fā)生高血糖后，小鼠稱重后按隨機數(shù)字表法將糖尿病小鼠分為對照組（n=5）、生理鹽水組（n=10）、TUDCA組（n=10）和毒胡蘿卜內(nèi)酯組（n=10）。在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的最后3周，TUDCA組、毒胡蘿卜內(nèi)酯組和生理鹽水組分別經(jīng)腹腔注射給予 TUDCA （250 mg/kg）、毒胡蘿卜內(nèi)酯（300 μg/kg）和等量生理鹽水，每日兩次（上午8:00和下午8:00），連續(xù)給藥3周。

主要實驗材料和試劑：高糖高脂飼料購于武漢春龍實驗動物飼料機械經(jīng)營部；STZ購于北京博愛港商貿(mào)中心；便 攜 式 穩(wěn) 步 系 列 血 糖 儀 及血糖試紙購于強 生（上海）醫(yī) 療 器 材 有 限 公 司 ；戊巴比妥鈉購于德國Merck公司；TUDCA購于美國Calbiochem公司；毒胡蘿卜內(nèi)酯購于美國 ALEXIS Biochemicals公司；小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于上海偉進生物科技有限公司；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ購于大連寶生物工程有限公司；引物購于上海生工生物工程有限公司；脂聯(lián)素抗體購于美國ABcom公司；CHOP抗體購于美國Proteintech公司。

2 型糖尿病動物模型：采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導小鼠發(fā)生高血糖。先給予35只小鼠標準的嚙齒類動物飼料適應性喂養(yǎng)1周，1周后給予脂肪含量為60%的高糖高脂飼料喂養(yǎng)，于第3周末腹腔注射STZ 85 mg/kg（連續(xù)注射兩天，1 次/天），給藥后繼續(xù)給予脂肪含量為60%的高糖高脂飼料喂養(yǎng)，高糖高脂飼料喂養(yǎng)共3個月。應用便攜式穩(wěn)步系列血糖儀檢測空腹血糖并記錄體重[18，19]時間點為：給藥前及第4、5、7個周末，最后為第3個月末。血 糖 ≥16.7 mmol/L 認 為糖 尿 病 模 型 建 立 成 功。

小鼠在體心肌梗死模型：糖尿病模型建立成功后，除對照組外，從其他各組的10只小鼠中隨機選5只進行心肌梗死手術。用2%戊 巴比妥鈉溶液經(jīng)腹腔給藥麻醉小鼠 ，剪去小鼠胸前毛，快速開胸，開口處于小鼠左側第4肋間，迅速擠出心臟，用6-0絲 線 在 小 鼠 冠 狀動脈 左 前 降 支 距 根 部2～3 mm處打一死結造成心肌缺血，迅速關閉小鼠胸腔。

標本的收集與處理：（1）血清的收集與處理：心肌梗死72 h后，用2%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射將小鼠麻醉后，將小鼠頭朝下倒置片刻使其頭部充血，再用無齒眼科鑷子摘取小鼠眼球取血，將血至于1.5 ml離心管中室溫靜置30 min后，再放于4℃冰箱中靜置30 min后，離心15 min（8000 g），取上清后，分組標記后，-80℃冰箱保存，后用ELISA法檢 測血 清 脂 聯(lián) 素 含 量 。（2）心肌的收集與處理：心肌梗死72 h后，用2%戊 巴 比 妥 鈉 將小鼠麻醉后，打開小鼠胸腔，分離心臟，剝離心臟，用 冰 生 理 鹽水 將 心 腔 內(nèi) 血 液 沖 洗 干 凈 ，分組標記后，放于-80℃冰箱保存后，用三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法檢測心肌梗死范圍。免 疫 組 織 化 學 法 檢測心肌組織中脂聯(lián)素以及CHOP，實時定量熒光聚合酶鏈式反應（Real time-PCR）方法檢測心肌組織中脂聯(lián)素以及CHOP的表達水平。

心肌梗死面積測定：小鼠缺血72 h后，取心肌用于檢測心肌梗死范圍。用2%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后，打開小鼠胸腔，分離心臟，剝離心臟，-20℃凍存1 h后，將冰凍后的心臟做垂直左心室長軸連續(xù)環(huán)切，每片厚 1～1.5 mm，將心肌組織置于 1% TTC液中 37℃水浴 15 min（避光、每1 min翻面1次），取出切片，用濾紙吸干液體后，在10%福爾馬林中固定20 min后取出，用濾紙吸干液體后照相，正常區(qū)域為紅色，梗死區(qū)為白色。用Image J軟件分析照片。以梗死心?。ò咨珔^(qū)）與全左心室心?。t色區(qū)與白色區(qū)）的比值表示心肌梗死面積。

血清脂聯(lián)素檢測：使用ELISA法檢測血清脂聯(lián)素濃度[20]，按照試劑盒說明書步驟操作。得到數(shù)據(jù)后，以標準品的濃度為橫坐標，光密度（OD）值為縱坐標，繪制標準曲線；根據(jù)OD值查找各自對應的濃度。

免疫組織化學法檢測心肌組織中脂聯(lián)素以及CHOP含量：用顯微鏡觀察并拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度（IOD）值。陽性表達越強、IOD值越大，含量也越大。每組所有照片的平均IOD值代表該組的IOD值用均數(shù)±標準差表示。

Real time-PCR 方法檢測心肌組織中脂聯(lián)素mRNA以及CHOP mRNA表達水平：先根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，再根據(jù)One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ的說明配制反應體系進行Real Time One Step RT-PCR反應，反應完畢后，將樣本的擴增曲線、融解曲線、CT值導入Word文檔中，待數(shù)據(jù)分析。

引物序列如下：CHOP：上游引物：5'-AAGTCAGCCCGAGAAGAACC-3'，下游引物：5'-TGTGAAGGTCCAACTCAAGA-3'；脂聯(lián)素：上游引物：5'- CCGCTTATGTGTATCGCTCCG -3'，下游引物：5'- TGGTCGTAGGTGAAGAGAAAG-3'；β-肌動蛋白：上游引物：5'- ATATCGCTGCGCTGGTCGGC-3'，下游引物：5'- AGGATGGCGTGAGGGAGATC-3'。

統(tǒng)計學處理：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布檢驗、方差齊性檢驗，不同組間均采用One-way ANOVA單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

4組小鼠心肌梗死面積比較：TUDCA組和生理鹽水組小鼠心肌梗死面積分別為（21.47±2.85）%和（39.92±4.28）%，均小于毒胡蘿卜內(nèi)酯組[（66.56±8.15）%，P<0.01]。

ELISA法檢測血清脂聯(lián)素濃度（表1）：TUDCA組與生理鹽水組血清脂聯(lián)素濃度均高于毒胡蘿卜內(nèi)酯組（P<0.01），各組心肌梗死前血清脂聯(lián)素濃度較心肌梗死72 h時水平高（P<0.01）。

表1　4組小鼠血清 脂 聯(lián) 素 濃 度比較（pg/ml，?±s）

4組小鼠心肌組織中脂聯(lián)素及CHOP含量比較（表2）：TUDCA組和生理鹽水 組小鼠心肌組織中脂聯(lián)素含量均高于毒胡蘿卜內(nèi)酯組（P<0.01），各組小鼠心肌梗死前心肌組織中脂聯(lián)素含量均高于心肌梗死72 h（P<0.01）。TUDCA組和生理鹽水 組小鼠心肌組織中CHOP含量低于毒胡蘿卜內(nèi)酯組（P<0.01），各組小鼠心肌梗死前心肌組織中CHOP含量均低于心肌梗死72 h（P<0.01）。

表2　4組小鼠心肌組織中脂聯(lián)素及CHOP含量比較

4組小鼠心肌組織中脂聯(lián)素mRNA及CHOP mRNA表達水平比較（表3）：生理鹽水組和TUDCA組小鼠的心肌組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平均高于毒胡蘿卜內(nèi)酯組（P<0.01），各組小鼠心肌梗死前心肌組織中脂聯(lián)素mRNA表達水平均高于心肌梗死72 h（P<0.01）。生理鹽水組和TUDCA組小鼠心肌組織中CHOP mRNA表達水平低于毒胡蘿卜內(nèi)酯組（P<0.01），各組小鼠心肌梗死前心肌組織中CHOP mRNA表達水平均低于心肌梗死72 h時水平（P<0.01）。

表3　4組小鼠心肌組織中脂 聯(lián) 素 mRNA及CHOP mRNA表達水平比較

3　討論

多項研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，心肌組織結構和（或）功能發(fā)生改變[21]，對缺血損傷敏感性增加，即在糖尿病狀態(tài)下，心肌組織本身對缺血具有高敏感性，容易發(fā)生缺血性損傷。但是這種易感性增高的具體機制并不十分明確。

多種因素如低氧、高血糖、化學毒物等能誘發(fā)ERS[10-12]，而誘發(fā)因素的持續(xù)存在能導致ERS持續(xù)存在并逐漸加重。由于本研究中實驗組均為糖尿病組，故而所指ERS為持續(xù)性ERS。ERS 誘導細胞凋亡主要通過三種途徑: CHOP 途徑、細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1-c-Jun N-末端激酶（ASK1-JND）途徑和半胱氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）途徑[22，23]。本研究通過測量CHOP的表達來衡量ERS，發(fā)現(xiàn)各組心肌梗死前心肌組織中CHOP的表達水平及含量均低于心肌梗死72 h時水平，提示ERS與2型糖尿病心肌缺血損傷有相關性。此外， TUDCA組小鼠心肌梗死72 h心肌組織中CHOP的表達水平以及含量均低于毒胡蘿卜內(nèi)酯組，表明心肌梗死72 h TUDCA組小鼠ERS的程度低于毒胡蘿卜內(nèi)酯組。同時心肌梗死72 h TUDCA組小鼠心肌梗死面積小于毒胡蘿卜內(nèi)酯組，提示緩解ERS能減輕缺血心肌的受損程度。而抑制ERS和炎癥，能阻止2型糖尿病小鼠缺血損傷誘導的血管病變[24]。綜合這些結果，我們可以得出ERS與2型糖尿病缺血心肌受損程度正相關。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，血漿脂聯(lián)素水平與心肌梗死發(fā)病率呈明顯負相關，2 型糖尿患者血液中脂聯(lián)素水平降低不僅可能參與糖尿病所致的缺血性心臟病的發(fā)生，也可能是糖尿病患者缺血性心臟病發(fā)作后心肌損傷程度加重的重要原因。在心肌細胞中，脂聯(lián)素通過磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）通路抗凋亡和環(huán)氧合酶2-前列腺素E2-受體EP4（COX2-PGE2-EP4）通路抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生，從而保護缺血再灌注心臟。也可以通過抑制誘導型一氧化氮合酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表達進而抑制氧化/硝化聯(lián)合應激，直接保護心肌[8]。

在心臟損傷的研究中，臨床資料顯示血漿脂聯(lián)素濃度持續(xù)降低可以顯著增加糖尿病患者急性心肌梗死的發(fā)生率，同時，脂聯(lián)素的血漿水平與心肌梗死面積和左心室射血分數(shù)呈高度負相關[25]。脂聯(lián)素基因敲除小鼠心肌缺血/再灌注損傷明顯加重，而補充外源重組脂聯(lián)素具有明確的心臟保護作用。越來越多的數(shù)據(jù)顯示，血漿脂聯(lián)素水平較低的人群，其缺血性心臟病發(fā)病率較高，提示脂聯(lián)素水平降低可能是導致冠狀動脈損傷和心肌缺血的重要原因。本研究結果與早期發(fā)現(xiàn)一致。

在3T3-L1脂肪細胞中，誘導ERS有效促進自噬相關的脂聯(lián)素降解，相反，抑制ERS后3T3-L1脂肪細胞中脂聯(lián)素水平增加，緩解了小鼠體內(nèi)高脂飲食誘導的脂聯(lián)素水平下調(diào)[26]；此外，ERS在糖尿病、肥胖引起的脂聯(lián)素下調(diào)中起到關鍵作用：ERS持續(xù)加重的過程中，脂聯(lián)素多聚體的合成及分泌減少，提示ERS是細胞中脂聯(lián)素水平下調(diào)的原因[27]。本實驗結果顯示，ERS加重能下調(diào)脂聯(lián)素的水平，而緩解ERS可以減輕脂聯(lián)素水平的下調(diào)，ERS與脂聯(lián)素的水平負相關，ERS可能通過下調(diào)脂聯(lián)素的水平，增加了缺血心肌的易損性。但ERS下調(diào)脂聯(lián)素的機制有待進一步研究。

另一方面，應用脂聯(lián)素受體激動劑或將上調(diào)脂聯(lián)素受體水平作為治療靶點可保護缺血心臟；而脂聯(lián)素信號受損則可加重缺血心肌損傷。但脂聯(lián)素基因敲除或補充外源重組脂聯(lián)素對ERS下調(diào)脂聯(lián)素水平有何影響；給予加重ERS的藥物后補充外源重組脂聯(lián)素，2型糖尿病缺血心肌受損程度能否緩解，均有待進一步研究。

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（編輯：許菁）

難忘病例

收稿日期：（2015-06-30）

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）01-0091-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.020

作者簡介：顧晨 住院醫(yī)師 碩士 研究方向為心血管疾病分子機制 Email: 382197751@qq.com 通訊作者：李俊明 Email: lijunming@medmail.com.cn

基金項目：湖北省教育廳自然科學研究項目（D20121309）；國家自然科學基金面上項目（81270280）

目的：研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）與脂聯(lián)素的相關性及其在2型糖尿病缺血心肌易損性增強中的作用。

方法：35只C57BL/6J 雄性小鼠采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導2型糖尿病模型，按隨機數(shù)字表法將糖尿病小鼠分為對照組（n=5）、?；敲撗跄懰幔═UDCA）組（n=10）、毒胡蘿卜內(nèi)酯組（n=10）和生理鹽水組（n=10）。對照組不做任何處理，其他三組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的最后3周，分別用TUDCA（250 mg/kg）、毒胡蘿卜內(nèi)酯（300 μg/kg）和等量生理鹽水腹腔注射給藥，2次/天，連續(xù)給藥3周后，TUDCA組、毒胡蘿卜內(nèi)酯組和生理鹽水組各隨機選取5只建立小鼠在體心肌梗死模型。心肌梗死72 h后，檢測心肌梗死面積、血清脂聯(lián)素含量、心肌組織中脂聯(lián)素和凋亡相關蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）的含量及脂聯(lián)素和CHOP mRNA表達水平。

結果：TUDCA組及生理鹽水組小鼠心肌梗死面積分別為（21.47±2.85）%和（39.92±4.28）%，均小于毒胡蘿卜內(nèi)酯組[（66.56±8.15）%，P均<0.01]。心肌梗死前，TUDCA組[（79.25±6.40） pg/ml]和生理鹽水組[（70.23±4.15）pg/ml]血清脂聯(lián)素濃度均高于毒胡蘿卜內(nèi)酯組[（62.64±5.70）pg/ml，P均<0.01]，各組小鼠心肌梗死前血清脂聯(lián)素濃度均高于心肌梗死72 h時濃度；各組小鼠心肌組織中脂聯(lián)素含量及mRNA表達水平檢測結果與血清脂聯(lián)素檢測結果一致，而CHOP含量及mRNA表達水平檢測結果則與之相反。

結論：2 型糖尿病導致的心肌缺血損傷加重與ERS相關；ERS可能在2型糖尿病心肌易損性增強中起著重要作用，ERS加重后通過下調(diào)脂聯(lián)素水平，增加了2型糖尿病心肌易損性。關鍵詞 糖尿病，2 型；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；心肌缺血

作者單位：443002 湖北省宜昌市，三峽大學人民醫(yī)院（宜昌市第一人民醫(yī)院）