方 正 齊美園 趙鵬昊 張 青 朱云鵬（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

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基于乳酸菌試管計數(shù)法的改進研究

方 正 齊美園 趙鵬昊 張 青 朱云鵬
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

摘 要：研究表明試管計數(shù)法利用高層瓊脂的良好厭氧性能夠很好地培養(yǎng)和計數(shù)乳酸菌，而實驗發(fā)現(xiàn)試管法在菌落計數(shù)的過程中，仍有部分缺點和不足。本研究對原試管法的裝置做了新的改進，將改進后的試管法與原試管法對比，證實了改進后的試管法能夠更快速、準確地對乳酸菌進行計數(shù)。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；計數(shù)；試管法；改進

目前，乳酸菌已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，研究表明大部分乳酸菌為微好氧菌、兼性厭氧菌或?qū)Ｐ詤捬蹙?，馬向前等率先提出利用試管法對乳酸菌等不產(chǎn)氣厭氧或兼性厭氧菌的簡便快速活菌計數(shù)，趙強忠等又在前者的實驗基礎(chǔ)上進行了方法上改進，但由于很多菌落生長在試管中間且分布無序以及試管構(gòu)造的特點，觀察時易產(chǎn)生重影，導(dǎo)致不易計數(shù)。

本研究為了使試管法能夠更快速、準確計數(shù)，對原試管法的裝置進行了改進。裝置描述：將大試管（外管）加上硬質(zhì)橡膠塞，橡膠塞上連有灰黑色的同材質(zhì)實心柱體（內(nèi)芯），內(nèi)芯與外管間形成薄層區(qū)域。使用方法：在無菌的環(huán)境中，將已經(jīng)滅菌的橡膠塞拔下，取融化的約10mL瓊脂培養(yǎng)基注入大試管中，接種后，蓋上橡膠塞，此時培養(yǎng)基被內(nèi)芯擠壓到外管的周圍，形成一個薄的培養(yǎng)基層，用于乳酸菌的培養(yǎng)和計數(shù)。本試驗通過將改進后的試管法作為試驗方法，趙強忠等所用的原試管法作為對照，研究改進后的試管法的實際使用效果。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

鼠李糖乳桿菌GG株（下簡稱LGG）、保加利亞乳桿菌（下簡稱LB）。（由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品教育部重點實驗室提供）

1.1.2培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，按GB 4789.35-2010配制。

1.1.3試劑：草酸銨結(jié)晶紫，碘液，番紅，酒精等。

1.1.4儀器和設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；電熱恒溫水浴鍋；振蕩器；移液器；顯微鏡；錐形瓶；酒精燈等。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌的活化和鏡檢

將LGG和LB按3%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，再分別于37℃和42℃恒溫箱培養(yǎng)16h和24h，重復(fù)活化培養(yǎng)3代。革蘭氏染色后鏡檢無雜菌，備用。

1.2.2稀釋液的配制

準確稱量0.90g無水NaCl，加入100g水，攪拌溶解均勻，取9mL分裝試管。121℃滅菌15min。

1.2.3乳酸菌的計數(shù)

（1）菌液稀釋

將活化后的菌液在振蕩器上震蕩均勻，用移液器移取1mL，加入含有9mL試管的稀釋液中，制成1∶10的稀釋液，并在振蕩器上震蕩均勻，依此類推進行10倍稀釋，將菌夜稀釋到10-7。

（2）接種

改進后的試管法（方法一）：按照前述使用方法，將稀釋到10-6、10-7的菌液分別取0.1mL接種，注意管中不能有氣泡產(chǎn)生，做三個平行樣。將LGG和LB分別在37℃和42℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

原試管法（方法二）：將稀釋到10-6、10-7的菌液分別取0.1mL接種到滅菌的試管培養(yǎng)基中，震蕩均勻，不能有氣泡產(chǎn)生，做三個平行樣。將LGG和LB分別在37℃和42℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

（3）菌落的計數(shù)

將兩種方法所得到的試管菌落分別進行計數(shù)，記錄菌落數(shù)量與計數(shù)時間。

2　結(jié)果和分析

2.1兩種方法的結(jié)果比較

2.1.1方法一和方法二的菌落數(shù)

表1為方法一和方法二的菌落數(shù)。

2.1.2方法一和方法二的計數(shù)時間

表2為方法一和方法二的菌落計數(shù)時間。

2.2數(shù)據(jù)處理與分析

參考GB4789.35-2010中乳酸菌的檢驗與計數(shù)方法，若取有兩個連續(xù)稀釋度的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式計算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d

式中：

N——樣品中菌落數(shù)；∑C——試管菌落數(shù)之和；n1——低稀釋倍數(shù)的試管個數(shù)；n2——高稀釋倍數(shù)的試管個數(shù)；d——稀釋因子（低稀釋倍數(shù)）。

由表1可知，方法一的同一批次中，三個平行樣無顯著性差異，檢出數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，且兩個稀釋度的的比值都接近理論值10，而方法二中有三組偏離10較顯著。根據(jù)公式計算，方法一對LGG 和LB的計數(shù)結(jié)果分別是2.16×109cfu/mL 和1.40×109cfu/mL，方法二對LGG和LB的計數(shù)結(jié)果分別是2.09×109cfu/mL和1.27×109cfu/mL，可知方法二所得菌落數(shù)小于方法一，說明了改進后的試管法對菌數(shù)計數(shù)的檢出率和準確性都優(yōu)于原試管法。

由表2可知，在菌落數(shù)較少（試驗中小于30）時，方法一和方法二的計數(shù)時間相差不大，但當(dāng)菌落個數(shù)較多（試驗中大于100）時，對于菌落數(shù)量相差不大進行數(shù)時方法二計數(shù)時間長，計數(shù)較為困難，此時改進后的試管法具有明顯的優(yōu)越性，體現(xiàn)在計數(shù)時間短，重復(fù)率更好。

表1　

表2　

結(jié)語

本研究中提出的基于原乳酸菌試管計數(shù)法的改進，有效地解決了原試管法中因菌落數(shù)多、中間部分菌落計數(shù)困難的缺點，具有原試管法的檢出率高和重復(fù)性高等優(yōu)點，且具有不易重復(fù)計數(shù)，計數(shù)更快等優(yōu)點，是一種更加高效、簡便的乳酸菌計數(shù)方法。本法亦可應(yīng)用于其他兼性厭氧菌、耐氧性厭氧菌、微好氧菌等的培養(yǎng)和計數(shù)。

參考文獻

[1]趙強忠，趙謀明，蔣文真.一種分離和檢測酸乳中乳酸菌的有效方法[J].食品與工發(fā)酵，2007，33（03）：96-99.

[2]孟祥晨，杜鵬，李艾黎.乳酸菌與酸奶發(fā)酵劑[M].北京：科學(xué)出版社，2007：12-15.

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