李欣穎，關海東，王 巍

（1.中國醫(yī)科大學臨床二系 沈陽 110001；2.第三軍醫(yī)大學學員旅十二營 重慶 400038；3.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 沈陽 110001）

MicroRNA與胰島β細胞的再生與分化及中藥的靶向治療＊

李欣穎1，關海東2，王 巍3＊＊

（1.中國醫(yī)科大學臨床二系 沈陽 110001；2.第三軍醫(yī)大學學員旅十二營 重慶 400038；3.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 沈陽 110001）

microRNA（miRNA）是一類長度約為18-25個核苷酸的非編碼RNA，參與基因的轉錄后調控過程。近年研究發(fā)現，miRNA在胰腺發(fā)育、胰島素基因的表達、胰島素的合成和分泌過程中發(fā)揮著重要調節(jié)作用。胰島內一些miRNA可影響胰島β細胞的增殖和分化。miRNA具有組織特異性，其表達改變與某些疾病的發(fā)生密切相關；而與中醫(yī)證候本質的相關聯(lián)研究可為糖尿病的中醫(yī)藥治療提供新的思路。

microRNA 胰島β細胞 再生 分化 中醫(yī)藥治療

胰島素是人體內由胰島β細胞分泌的唯一降低血糖的激素，其合成與分泌不足及功能缺陷會引發(fā)多種代謝性疾病，例如：糖尿病。近年來，糖尿病的患病率正逐步增加[1]。miRNA是一種可對基因表達進行微調的分子，在真核細胞中廣泛存在，日益受到人們的重視而成為生命科學研究熱點之一。其轉錄后的調控作用可參與胰島細胞的增殖和分化，影響胰島素的分泌及其生理作用，與糖尿病的發(fā)生密切相關。本文針對近年來發(fā)現的與胰島β細胞再生和分化相關的miRNA及其主要作用進行歸納，并探討其作用機理；對miRNA參與中藥有效成分改善糖尿病的機理作總結和展望，試圖為糖尿病的中醫(yī)藥治療提供新的思路。

1 miRNA概述

miRNA是長度約為18-25個核苷酸的內源性非編碼小RNA分子，廣泛存在于真核生物中，首次由美國著名遺傳學家Lee等[1]于1993年發(fā)現（線蟲C.elegans體內的lin-4和let-7基因）。miRNA具有組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性。研究表明，miRNA并不是由其相應基因直接編碼形成的，而是由細胞核內編碼miRNA的基因經聚合酶Ⅱ（少數由聚合酶Ⅲ）轉錄得到pri-microRNA（大約300-l 000 bp），然后再經剪切加工成成熟的miRNA[2]。它們通過與靶基因轉錄后的信使RNA（mRNA）3’UTR序列互補結合進而調節(jié)靶基因的表達[3]。

人類約有三分之一的基因表達受miRNA的調節(jié)。成熟的miRNA在生物體內主要通過兩種機制對靶基因的表達進行調控，即靶mRNA切割降解和翻譯抑制。前者miRNA的結合位點通常在靶mRNA的編碼區(qū)域或開放閱讀框中；后者則因miRNA與靶mRNA不能夠完全互補配對。因此，miRNA通常作用于在蛋白質翻譯水平，抑制靶mRNA的翻譯表達即起到抑制靶基因的作用。后者miRNA的結合位點通常在靶mRNA的3’UTR區(qū)，大多數miRNA通過這種方式發(fā)揮作用[4,5]。至今，還有很多miRNA的作用機理并不清楚，其中存在多種作用途徑有待深入研究。

2 參與胰島β細胞群動態(tài)平衡的miRNA

成人體內的胰島β細胞團數量總是維持動態(tài)平衡。在生理和病理條件下，細胞水平的再生可增加胰島分泌細胞的數量；對糖尿病患者而言，可以滿足其自身胰島素需求，對血糖的控制起到重要的代償作用。體內β細胞群動態(tài)平衡的維持主要通過以下5種方式。

2.1 殘留胰島β細胞的自我增殖

胰島β細胞的自我增殖是其再生的重要方式之一。胰腺部分切除術后殘留胰島β細胞的自我增殖主要與神經元素3（Neurogenin 3，Ngn3）、表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）和胃泌素等蛋白因子的刺激作用相關[6]。CCK能夠激活神經鈣蛋白調節(jié)的活化T細胞核因子（Nuclear factor of activated T-cells，NFAT）信號通路，從而引起胰腺腺泡細胞生長。胰島前體細胞內有Ngn3基因的表達，Ngn3能夠促進胰島細胞分化為5種內分泌細胞，即β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞和PP細胞[7]。Ngn3基因通過啟動相關轉錄因子的表達，來刺激胰島β細胞的增殖，促進導管來源的β前體細胞的增殖和定向分化，這在胰腺發(fā)育過程中必不可少[8]。5’-一磷酸腺苷（Adenosine 5’-monophosphate，AMP）依賴的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的3’UTR區(qū)有miR-29a的結合位點，乏氧條件下可上調miR-29a使胰島中AMPK α2表達增加，從而抑制胰島β細胞增殖、促進其凋亡和自噬[9]。其中可能的機制是miR-29a激活了AMPK級聯(lián)反應，導致胰島內線粒體解耦聯(lián)蛋白（Uncouplingprotein2，UCP2）表達的增加，繼而產生了線粒體活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）從而調節(jié)細胞自噬。UCP2控制線粒體ROS的產生是治療糖尿病等疾病的潛在靶點[10]。

2.2 α細胞轉分化為β細胞

小鼠胰腺內的胰島α細胞可以在不經任何人工干擾的情況下，向胰島β細胞轉分化[11]。配對盒基因4（Paired Homeobox Gene 4，Pax4）、NK同源異型域因子6.1（NK-homeo Domain 6.1，Nkx6.1）、胰腺十二指腸同源異型框基因1（Pancreatic Duodenal Homeobox Gene-1，Pdx-1）都是這一過程不可或缺的轉錄因子/蛋白因子。當Pax4出現恰當的異位表達時，可以誘導α細胞轉分化為β細胞。Nkx 6.1在成熟β細胞中存在特異表達，可能對胰高血糖素基因的抑制和β細胞專一基因的激活有促進作用[12]。

2.3 胰腺導管細胞轉分化為β細胞

胰腺導管上皮細胞具有干細胞特性。Notch信號依賴的分子網絡能啟動胰腺內分泌細胞和導管上皮細胞向胰島β細胞的轉分化[12]。Notch基因的高表達可阻斷胰腺的內分泌分化進程，并能誘導Ngn3阻遏蛋白Hes1基因的表達。此外，Notch能激活Sox9基因的表達，Sox9基因高表達會使胰島細胞數量增加[12]。胰腺術后大部分新生β細胞來源于胰腺導管上皮細胞的分化，肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）這類調節(jié)因子促成這一過程。HGF是一種肝細胞有絲分裂原，它與特異性膜受體c-met結合發(fā)揮多樣作用。HGF能促進β細胞的增殖和胰腺導管細胞向β細胞的轉分化，在聯(lián)合β細胞因子刺激轉分化的效率明顯提高[13]。miR-503、miR-375及miR-541在胚胎胰腺組織導管上皮中表達豐富，對β細胞再生和分化的促進作用可能與上述機制密切相關[14]。

2.4 胰腺前體細胞和腺泡細胞分化為β細胞

Pdx1、Ngn3和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A（MafA）等因子參與這一過程。

miR-15a、miR-16、miR-106b、miR-195和miR-15b在轉錄后水平調節(jié)修飾Ngn3的表達，可影響內分泌前體細胞的形成。miR-17-92家族聚集簇（包括miR-19b）同NeuroD1的3’-UTR序列結合而抑制其表達。NeuroD1基因是決定胰腺內分泌細胞命運和胰島素基因表達的一個重要調節(jié)因子。在胰腺內分泌細胞中存在過表達的NeuroD1同其下游的Islet-1因子的表達可促使胰腺祖細胞向內分泌細胞進行分化[12]。miR-145、miR-495和miR-18a可能影響胰腺前體細胞的分化，這一過程是通過抑制Ptf1a（即靶p48基因）的表達而實現[15]。在神經元的發(fā)育中miR-23b能夠調控Hes1基因的表達，對胰腺內分泌細胞的分化有側向抑制作用[16]。

2.5 干細胞分化為β細胞

干細胞是指具有分化潛能的細胞，根據其來源可分為胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）、成體干細胞（Adult Stem Cells，AS）和誘導多能干細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）。向ESCs中轉入胰島發(fā)育相關的關鍵轉錄因子（如：Pax4、Pdx1等）、iPSCs經細胞因子ECG的誘導，就可以誘發(fā)其向胰島細胞的定向分化[17]。多潛能性基因Oct4、Sox2和Nanog可調控miR-302和miR-290-295在小鼠的胚胎干細胞中的富集表達，其中Sox2也可能作為這兩種miRNA的靶基因[18]。miR-145、miR-21對干細胞轉錄因子Oct4、Sox2及Klf4的表達有負性調控作用，可影響人類ESCs的自我更新和分化狀態(tài)[19]。

3 重要的miRNA對胰島β細胞再生分化的調節(jié)作用

Poy等[20]從小鼠β細胞系MIN6和α細胞系TC1中檢測出67余種miRNA。胰島素主要由胰腺β細胞分泌，若其數量不足或功能缺失，個體分泌胰島素的能力會下降，高糖環(huán)境的反饋調節(jié)亦會加劇β細胞的功能失調，最終導致糖尿病、心臟病、腎病等的周身重要臟器的損害。β細胞的基因表達及miRNA的表達水平都受到機體血糖水平實時調控，失調的miRNA會對β細胞的發(fā)育和功能產生影響，詳見表1。

3.1 miR-375參與胰島細胞增殖、分化、轉分化

miR-375是首個發(fā)現與糖代謝有關的miRNA，在胰島中高度表達。Poy等[17]研究發(fā)現抑制內源性miR-375的功能不僅減少胰島素的分泌且會影響胰島β細胞的增殖。缺乏miR-375的小鼠（mi-375敲除）全胰島α細胞的數量增加而胰島β細胞團數量下降，導致血糖水平升高[19]。Ouaamari等[19]發(fā)現miR-375的作用與PI3-K通路關系密切，3’磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-Phosphoinositide-Dependent Protein Kinase-1，PDX1）是miR-375已證實的靶基因之一，miR-375的過表達可下調PI3-K通路中的靶PDK1使胰島素基因表達減少，胰島β細胞增殖受抑。miR-375對胰島β細胞的分化亦有調節(jié)作用，在沒有任何外源性輔助因子的作用下，高表達的miR-375能誘導hESCs分化為類β細胞樣胰島素生成iPSCs，且誘導生成的iPSCs完全具備成熟β細胞的特征：即在葡萄糖的刺激作用下會分泌胰島素，且在iPSCs中并沒有觀察到胰高血糖素或生長抑素與胰島素的共表達。分析hESCs向iPSCs分化過程中miRNA表達譜的動態(tài)變化，發(fā)現miR-375在iPSCs分化早期表達增加，隨后下降，miR-375對胰島胚胎發(fā)育中特異靶基因HNFflβ和Sox9有負調控作用，它們的表達均呈現先下降后增加的變化，表明miR-375以時空特異性的方式，促進胰島β細胞的分化和成熟，但其具體機制仍不清楚[20]?？赡苡捎趆ESCs細胞系以及誘導方式不同，分化而成的iPSCs并不一定具有成熟β細胞特征。

3.2 miR-124a/let-7b參與胰島β細胞的分化

Krek等[21]研究發(fā)現miR-124a在MIN6中高度表達，與miR-375有協(xié)同作用，表現在可以共同抑制靶基因肌侵蛋白（Myotrophin）的表達。miR-124a可以通過調控FoxA2的表達而發(fā)揮作用，FoxA2是一種已經明確的miR-124a靶基因，它對胰島β細胞分化、胰腺生長、葡萄糖代謝和胰島素分泌均具有重要調節(jié)作用。Baroukh等[22]發(fā)現miR-124a編碼FoxA2 mRNA的3′UTR區(qū)，即可以直接調控FoxA2的蛋白表達水平。隨著FoxA2基因表達水平的下降，其下游的靶基因包括Pdx1、Kir6.2和磺脲類受體1（Sulfonylurea Receptor 1，SUR1）的表達隨之下調，胰腺發(fā)育及胰島素的降糖功能受抑制。在已分化的胰島β細胞中，miR-124a對FoxA2的調控對于胰島素的分泌和血糖的代謝有很大影響，即在基礎條件下miRNA-124a可促進胰島素的分泌，在高糖條件下會對胰島素的分泌起到抑制作用。此外，Chen等[23]揭示miR-124a可促進細胞發(fā)生間質上皮轉化，這一過程的發(fā)生可能是由于細胞內轉化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGFβ）的表達受抑制，TGF-β / TGF-β-R信號轉導受阻，miR-124a可能抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（Bone Morphogenetic Protein Receptor 1β，BMPR 1β）的表達進而阻礙胎盤間充質干細胞向成骨方向分化，從而誘導胰腺祖細胞分化的方向繼而增加β細胞的數量和效用。

3.3 miR-7參與胰島β細胞的增殖和分化

miR-7是一種在人和大鼠的胰島中表達最為豐富的miRNA，在14-18周胎齡的人胎兒胰島里表達較多，與此同時胰島內分泌激素的分泌量呈指數倍增加。與miR-375類似，miR-7在人類胰島的發(fā)育及分化過程中表達上調[24]。Nieto等[25]通過建立一個在胚胎E10.5期敲除miR-7的小鼠模型，觀測到胚胎內小鼠胰島素的合成減少、胰島β細胞數量減少且有出生后的糖耐量減低現象。進一步實驗于離體胰芽的培養(yǎng)中抑制miR-7的表達，發(fā)現胰島β細胞發(fā)生凋亡。上述諸研究都表明miR-7對于出生后β細胞團的形成，即miR-7對胰島β細胞增生和內分泌細胞的分化上的重要意義。miR-7是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白結節(jié)性硬化復合體-核糖體蛋白S6激酶1（mTORC1-S6K1）信號通路的重要組成部分[26]，抑制miR-7a可激活mTOR信號從而促進成年小鼠原代胰島β細胞的復制，即miR-7可作為成人β細胞增殖的開關。

3.4 miR-106b參與胰島內分泌前體細胞的形成、胰島β細胞分化

Ngn3基因是胰腺內分泌細胞發(fā)育的重要標志之一，它可以調控胰島干細胞、前體細胞的正常發(fā)育和定向分化，進而促進胰島β細胞的再生。研究中應用活化素A和B細胞素誘導小鼠骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Stromal Cells，bMSCs）分化成iPSCs，對miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配關系進行預測和鑒定顯示兩者靶向匹配關系良好，且miR-106b可直接調控Ngn3基因的表達。miR-106b能夠靶向作用于Ngn3的3′UTR區(qū)，進而抑制Ngn3的表達。此外，miR-106b的表達量隨著誘導時間的延長而逐漸降低，與Ngn3基因的表達量呈負性相關，這提示miR-106b參與了胰島素分泌細胞即胰島β細胞的誘導分化過程，這與其他幾種重要轉錄因子的相關性和具體的調節(jié)機制仍有待進一步的研究[27,28]。

3.5 miR-19b參與胰腺前體細胞向內分泌前體細胞的分化

miR-19是miR-17-92基因簇內的一個重要成員，在胰腺前體細胞中高度富集，而在胰腺內分泌前體細胞中表達呈現急劇下降趨勢，在分化細胞中則無表達，這提示在胰腺前體細胞向內分泌前體細胞的分化過程中有miR-19b的參與。進一步研究顯示，NeuroD是miR-19b作用的靶基因，miR-19b可同NeuroD的3’-UTR序列結合并抑制其表達，進而下調胰島素基因的表達過程[29]。

3.6 miR-9和其他相關miRNA的調節(jié)作用

除上述miRNA外，miR-9也可以調節(jié)β細胞的功能。在分泌胰島素的細胞系INS-1E中，高表達的miR-9對葡萄糖誘導的胰島素分泌的減弱過程是通過作用于胰島素調節(jié)因子Onecut2來實現的；miR-9還可以調節(jié)Sirtl基因的表達來調控胰島素的分泌[30-32]。

此外，炎癥因子誘導的miRNA亦會介導胰島β細胞的死亡，導致胰島素分泌的缺陷。例如：慢性炎癥中的炎癥因子TNFα和IL-1可以上調miR-21、miR-34a和miR-146的表達，這些miRNA進而調控胰島β細胞的分化和胰島素的分泌。另有其他研究提示miR-9、miR-133a、miR-29a和miR-96的高表達均可抑制胰島素的分泌；此外，miR-30d、miR-15a、miR-24、miR-148a和miR-182也參與并調控胰島素基因的表達[33]。

4 miRNA參與中藥有效成分改善糖尿病的機理

與西醫(yī)的治療糖尿病效果相比較，中醫(yī)的治療特點在于取材便利，療效持久，不良反應少，并可以有效地預防和緩解并發(fā)癥[34]。臨床上黃芪、人參、地黃、知母、黃連、大黃、馬齒覓、荔枝核等較常用，現有100余種中藥對糖尿病有抵抗作用。生物堿、多糖、黃酮、萜類、皂苷近年來研究較頻繁，它們作為中藥單體成分亦可對抗糖尿病的損害。

河思森等[35]和梁祎等[36]分別通過實驗闡明六味地黃湯和腎康丸能降低糖尿病大鼠的血糖水平，其機制是這兩種中藥能降低DM大鼠腎臟中TGF-β1生長因子、miR-192和Col1gen N的表達水平，而miR-192又能通過調節(jié)轉錄抑制因子Smad相互作用蛋白1來影響Col1gen N的表達以及蛋白的儲存，使得這兩種中藥能減少細胞外基質的分泌和沉積，從而減少腎間質性炎癥的發(fā)生幾率，得以規(guī)避或延緩糖尿病引發(fā)的腎功能損害。張茜等[37]通過實驗推測天麥消渴片可以上調糖尿病大鼠胰腺miR-375、miR-124a、miR-107和miR-30d的水平，其中miR-375可以刺激胰島β細胞增殖，抑制胰島α細胞增殖從而降低血糖，并且miR-30d也可以增加胰島素基因表達從而降低血糖，使得天麥消渴片可以改善糖尿病。

吳艷萍等[38]通過實驗發(fā)現大明膠囊降低了鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病大鼠的空腹血糖，并改變了大鼠胰腺組miRNA的表達譜；miRNA通過調節(jié)胰島素生成、分泌、葡萄糖代謝和胰島細胞的凋亡參與了大明膠囊的降血糖作用。周云楓等[39]通過實驗發(fā)現黃芪多糖可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，其機制與提高miRNA的表達水平有關，這些miRNA可以提高糖尿病大鼠腎組織的InsR、IRS-1、P13K基因水平，從而增加組織對胰島素的敏感性，改善胰島素信號轉導，進而改善糖尿病。李勇等[40]通過實驗發(fā)現生芪降糖顆?？梢越档蚼iRNA的表達水平，而miRNA可以調控ET-1、PKC因子的表達，導致生芪降糖顆粒能抑制ET-1、PKC的表達，并改善血管內皮功能，從而起到胰島素增敏及減輕胰島素抵抗的作用，進而緩解糖尿病各癥狀。

5 小結

各型糖尿病發(fā)生及發(fā)展的共同病理生理基礎是胰島內胰島素分泌相關的胰島β細胞產量不足以滿足機體能量代謝的需要，繼而發(fā)生糖、脂代謝紊亂，而高糖、高脂毒性又可反饋作用于胰島β細胞，加速細胞甚至器官和機體的功能衰竭。因此，從理論上而言，若能促進β細胞再生，阻止或逆轉β細胞數量減少、功能進行性喪失，則可以延緩或中斷上面所述的惡性循環(huán)過程。關于miRNA能否作為診斷標志物或治療性分子/靶點的評估才剛剛開始，因其應用前景的廣闊而成為研究熱點。在糖尿病的治療方面，西醫(yī)除強調控制血糖、血壓外，尚無特效藥物。若能從中醫(yī)出發(fā)找到有效成分從而調控胰島細胞相關的miRNA、相關通路及關聯(lián)基因，就可實現中西醫(yī)結合治療。目前，國內外學者已經開始應用miRNA芯片技術探索中醫(yī)證候的本質，若能與糖尿病胰島β細胞再生分化的機制相結合，將會更好指導和提高中醫(yī)藥的靶控治療效果。

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MicroRNAs with the Regeneration and Differentiation of Islet β cells and the Targeted Therapy of Traditional Chinese Medicine

Li Xinying1, Guan Haidong2, Wang Wei3
(1. Clinical Second Deparment, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Cadet Brigade Twelfth Battalion, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China;
3. School of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang 110001, China)

MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs about 18-25 nucleotides in length, involved in post-transcriptional genes regulation process. Previous studies showed that miRNAs played an important regulatory role in pancreatic development, gene expression, and synthesis and secretion of insulin. A variety of miRNAs which expressed in islet β cells may affect the proliferation and differentiation of islet β cells. Since miRNAs showed tissue specificity, their expression changes were closely related to some diseases. Thus, integrative studies with miRNAs over the essence of syndromes of traditional Chinese medicine could provide new ideas for the treatment of diabetes.

MicroRNAs, islet β cells, regeneration, differentiation, traditional Chinese medicine application

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.018

R2.15

A

2016-06-02

修回日期：2016-06-29

＊ 國家自然科學基金委青年科學基金項目（81502107）：NLRP3炎性體信號通路誘導胃癌上皮-間質轉化及侵襲轉移的研究，負責人：王??；遼寧省教育評價協(xié)會第一屆教學改革與教育質量評價研究立項課題（PJHYYB15125）：病理生理學教學系統(tǒng)整合PBL教學初探，負責人：王??；教育部2015年國家級大學生創(chuàng)新訓練項目省級乙類（2015053）：抑癌基因ARHI對胃癌細胞的抑制作用及其機制研究，負責人：王巍；教育部2014年國家級大學生創(chuàng)新訓練校級項目（2014090）：抑癌基因ARHI對胃癌細胞的抑制作用及其機制研究，負責人：王巍。

＊＊ 通訊作者：王巍，副教授，主要研究方向：病理生理學。