潘　磊　崔榮崗　趙保輝　李　華　張忠勇　王旭初

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(滄州 061001)

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蛤蚧肽溶液對非酒精性脂肪肝小鼠脂代謝、肝功能及炎性因子的影響*

潘磊崔榮崗趙保輝李華△張忠勇王旭初

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(滄州 061001)

摘要目的：探討蛤蚧對非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠脂代謝、肝功能及炎性因子的影響。方法：高脂飼料法復(fù)制NAFLD小鼠模型，以灌服復(fù)方蛋氨酸膽堿溶液為對照藥，蛤蚧組小鼠各亞組分別灌服高中低劑量蛤蚧肽溶液。以8周為觀察期，記錄各組小鼠干預(yù)前后脂代謝、肝功能及炎性因子指標(biāo)變化差異。結(jié)果: 干預(yù)8周后，各組小鼠MDA水平均同干預(yù)前對比無統(tǒng)計學(xué)意義；除空白對照組及模型組小鼠各檢驗指標(biāo)較干預(yù)前無明顯變化外，其余組小鼠TG、TC等脂代謝指標(biāo)，ALT、AST等肝功能指標(biāo)及IL-6、TNF-α等炎性因子指標(biāo)均較干預(yù)前顯著降低，SOD水平則顯著提升；低劑量組各指標(biāo)變化幅度均小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠；中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論: 中藥蛤蚧具有良好的抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功效，將其應(yīng)用于NAFLD小鼠的臨床治療中，能有效改善其肝功能，減輕炎性反應(yīng)，保肝效果較為突出。

主題詞 非酒精性脂肪肝@蛤蚧肽溶液脂類代謝肝功能炎性因子

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的病理綜合征，可大致分為原發(fā)性NAFLD和繼發(fā)性NAFLD兩種，原發(fā)性NAFLD的發(fā)生同遺傳易感性或胰島素抵抗等因素相關(guān)，繼發(fā)性NAFLD則是肥胖、合并糖尿病、高血脂癥、營養(yǎng)過剩等因素共同作用的結(jié)果[1-2]。當(dāng)前臨床對西藥治療NAFLD的研究報道較多，但鮮有就中藥蛤蚧在NAFLD患者中的臨床應(yīng)用價值展開分析[3]。對此，本次研究對50只小鼠中的24例予以灌服不同劑量蛤蚧溶液的方式，以為探討蛤蚧對NAFLD小鼠脂代謝、肝功能及炎性因子的影響，現(xiàn)報告如下。

1材料1.1實驗動物隨機(jī)選取50只健康雄性BALB/c小鼠，鼠齡6～8周，平均(7.2±0.6)周；體重(200～230)g,平均(217.3±3.9)g；飼養(yǎng)溫度溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，12h循環(huán)照明。所有受試小鼠均在入組前3d內(nèi)常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2材料及儀器高脂飼料(Research Diets公司生產(chǎn),規(guī)格12.5kg/箱，產(chǎn)品編碼ys000495),復(fù)方蛋氨酸膽堿片(規(guī)格：48s,國藥準(zhǔn)字H22025488),復(fù)方蛋氨酸膽堿溶液為1片復(fù)方蛋氨酸膽堿片混合10mL生理鹽水制備。蛤蚧肽溶液由我院制劑室制備，鮮活蛤蚧去頭與內(nèi)臟，低溫反復(fù)凍融3個周期，0.3%氯化鈉提取可溶性蛋白質(zhì)，過篩后濾液離心，再使用超濾膜過濾，去除大分子物后濾液行冷凍干燥，電泳鑒定純度，制成相對分子質(zhì)量為3000～20000的多肽制品；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等試劑盒均購于上海嵐派生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等試劑盒購于上海常斤生物科技有限公司；AU5800全自動生化分析儀由美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。

2實驗方法2.1模型建立及分組將適應(yīng)性喂養(yǎng)3d的50只小鼠隨機(jī)分為空白對照組(n=8)、模型組(n=8)、陽性對照組(n=10)和蛤蚧組(n=24)四組，再將蛤蚧組小鼠隨機(jī)分為高、中、低劑量等3個亞組，各8只。除空白對照組小鼠喂飼普通飼料外，模型組、陽性對照組、蛤蚧組小鼠均喂飼高脂飼料法復(fù)制NAFLD小鼠模型，4組小鼠均正常飲水。

2.2給藥方法空白對照組及模型組小鼠每日灌服生理鹽水，陽性對照組小鼠灌服復(fù)方蛋氨酸膽堿溶液，蛤蚧組小鼠則灌服蛤蚧肽溶液，低劑量組灌服100mg/kg，中劑量組灌服200mg/kg，高劑量組灌服400mg/kg，1d1次。持續(xù)干預(yù)8周后觀察各指標(biāo)差異。

2.3指標(biāo)檢測及方法ALT、AST等肝功能指標(biāo)由全自動生化儀測定；TG、TC等血脂指標(biāo)由全自動生化儀測定；SOD、MDA等氧化指標(biāo)均采用比色法測定；IL-6、TNF-α等炎性因子水平則由雙抗體夾心法測定。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法 有關(guān)實驗數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較采用方差分析，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。

3結(jié)果3.1脂代謝指標(biāo)干預(yù)前，空白對照組小鼠TG、TC、MDA等脂代謝指標(biāo)均顯著低于其他五組小鼠，且SOD水平顯著高于其他三組小鼠(P<0.05)；干預(yù)8周后，各組小鼠MDA水平均同干預(yù)前對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；除空白對照組及模型組小鼠各脂代謝指標(biāo)較干預(yù)前無明顯變化外，其余組小鼠TG、TC等脂代謝指標(biāo)均較干預(yù)前顯著降低，SOD水平則顯著提升(P<0.05)；其中低劑量組各指標(biāo)變化幅度小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠(P<0.05)，中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

3.2肝功能指標(biāo)見表2，干預(yù)前，空白對照組小鼠ALT、AST等肝功能指標(biāo)均顯著低于其他5組小鼠(P<0.05)；干預(yù)8周后，除空白對照組及模型組小鼠各肝功能指標(biāo)較干預(yù)前無明顯變化外，其余組小鼠ALT、AST等肝功能指標(biāo)均較干預(yù)前顯著降低(P<0.05)；其中低劑量組各肝功能指標(biāo)降幅均小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠(P<0.05)，中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3炎性因子見表3，干預(yù)前，空白對照組小鼠IL-6、TNF-α等炎性因子指標(biāo)均顯著低于其他5組小鼠(P<0.05)；干預(yù)8周后，除空白對照組及模型組小鼠各炎性因子指標(biāo)較干預(yù)前無明顯變化外，其余組小鼠IL-6、TNF-α等炎性因子指標(biāo)均較干預(yù)前顯著降低(P<0.05)；其中低劑量組各炎性因子指標(biāo)降幅均小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠(P<0.05)，中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4討論NAFLD是一種臨床常見的消化內(nèi)科疾患，以合并“三高”、體型肥胖、存在不良飲食習(xí)慣、缺乏日常鍛煉、有家族遺傳史等人群為主要患病群體，患者患病后多無自覺癥狀，少數(shù)可出現(xiàn)消化不良、肝脾腫大、肢體乏力等非特異性癥狀或體征[4-5]。早期診斷存在一定隱匿性，對患者健康安全威脅較大，積極有效的治療干預(yù)是促進(jìn)病情轉(zhuǎn)歸、改善其生活質(zhì)量的關(guān)鍵,當(dāng)前臨床對NAFLD的治療研究多集中于西藥方面[6]。少有報道就中藥材對NAFLD的臨床療效及應(yīng)用價值展開系統(tǒng)分析，對此，部分學(xué)者將非酒精性脂肪肝臨床治療的研究重點由西藥逐漸向中西醫(yī)結(jié)合方向轉(zhuǎn)移，試圖利用中醫(yī)藥辨證論治、整體調(diào)理的優(yōu)勢改善患者預(yù)后水平，促進(jìn)其病情轉(zhuǎn)歸。

蛤蚧是一種國家二級重點保護(hù)爬行動物，現(xiàn)代藥理研究表明，制備后的蛤蚧具有調(diào)節(jié)激素、抗衰老、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激忍耐性、抗炎癥、抗氧化等多種功效，在臨床多種疾病的治療中發(fā)揮積極影響[7]。當(dāng)前醫(yī)學(xué)界就中醫(yī)藥對NAFLD的療效研究多停留在活血化痰方、護(hù)肝降脂方等藥方，鮮少針對蛤蚧的臨床應(yīng)用價值展開深入分析[8-9]。對此，本次研究選取50只健康雄性小鼠為受試對象，發(fā)現(xiàn)予以蛤蚧肽溶液的蛤蚧組小鼠脂代謝水平、炎性因子水平及肝功能指標(biāo)等改善情況均顯著優(yōu)于建模后灌服生理鹽水的模型組小鼠，同歐麗娜等[10]報告結(jié)論基本一致，證實蛤蚧作為一種較常見的中藥材，具有抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝水平的功效，能以此改善機(jī)體肝功能，促進(jìn)病情轉(zhuǎn)歸，提高預(yù)后水平[11]。此前已有研究表明，蛤蚧性平、味咸、歸肺經(jīng)、腎經(jīng)，具有止咳、平喘、補(bǔ)肺、益腎、助陽、益精的功效，可用于腎虛陽痿、虛勞咳嗽、小便頻數(shù)等癥狀的治療中，均可獲得良好的療效[12-13]。隨著相關(guān)研究的深入，越來越多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，蛤蚧除了上述功效外，還具有提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、抗炎、提高機(jī)體應(yīng)激作用、改善細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激忍耐性、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝水平等其他作用，臨床應(yīng)用范圍較廣[14]。

相關(guān)研究表明，TNF-α作為一種炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)其他促炎因子增長，從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡，加劇病情發(fā)展。該炎性因子直接參與NAFLD的形成及發(fā)展過程，可通過損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、加快白細(xì)胞附著于肝竇內(nèi)皮速度等方式加重對患者肝功能的損害程度，推動病情發(fā)展，影響其預(yù)后恢復(fù)。不僅如此，還有報道稱，TNF-α能不同程度地干擾胰島素功能，降低機(jī)體對胰島素的敏感性，從而造成糖代謝及脂代謝紊亂癥狀，加重肝臟及其外圍組織的胰島素抵抗程度[15-16]。蛤蚧具有良好的抗炎作用，其進(jìn)入機(jī)體后能有效抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子水平，從而緩解炎癥反應(yīng)對肝功能的不良影響，達(dá)到促肝功能恢復(fù)、改善患者預(yù)后水平的功效。除上述結(jié)論外，本研究還就不同劑量的蛤蚧制劑對改善NAFLD小鼠的價值展開分析，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組臨床療效顯著優(yōu)于低劑量組，但中、高劑量組小鼠在各檢測指標(biāo)對比上差異較小，同謝晶日等報告結(jié)論基本一致[17]。因本次研究并未將不良反應(yīng)納入探究范圍，難以準(zhǔn)確評估蛤蚧的用藥安全性，故從治療安全性角度考慮，建議患者采用中劑量給藥方案，在確保臨床療效的同時提升用藥安全性，降低不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險，全面提升其預(yù)后質(zhì)量。

本次納入研究的小鼠數(shù)量有限，難以就中藥蛤蚧對NAFLD小鼠各炎性因子、脂代謝指標(biāo)及肝功能指標(biāo)的影響予以更準(zhǔn)確、深入的探究，對此筆者可擴(kuò)大樣本容量并盡可能排除相關(guān)干擾因素后予以進(jìn)一步分析，以獲得更精確的結(jié)論，為NAFLD的臨床治療提供新思路。

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(收稿2015-10-22；修回2015-11-30)

Effect of Gekko gecko peptide solution on lipid metabolism liver function and inflammatory factors in rats with nonalcoholic fatty liver disease Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine in Cangzhou Hebei Province(Cangzhou 061001)

Pan LeiCui RonggangZhao Baohuiet al

ABSTRACTObjective：To investigate the effect of Gekko gecko on lipid metabolism, liver function and inflammatory factors in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods：NAFLD rats model was duplicated by high fat diet method. Mice administered orally compound methionine choline solution were included in the control group. The subgroups of Gekko gecko group were administered orally high, medium and low Gekko gecko peptide solution, respectively. Taking 8 weeks as the observation period, the differences in the changes of lipid metabolism, liver function and inflammatory factor indexes between groups before and after the treatment were recorded.Results：8 weeks of intervention later, there were no statistically significant differences in MDA levels in the group, compared with those before the intervention. Except that the test parameters of mice in the blank control group and the model group didn’t changed significantly, compared with those before the intervention TG, TC and other lipid metabolism indicators ALT AST and other liver function indicators and IL-6, TNF-α and other inflammatory factors in other groups were significantly lower than those before intervention while SOD levels were significantly improved. The changes of the indexes in the low dose group were smaller than those in the midium and high dose group and the positive control group.The differences between the midium, high dose group and the positive control group were not statistically significant. Conclusion：The traditional Chinese medicine Gekko gecko has good effects of anti-inflammation and regulating lipid metabolism.Its application in clinical treatment of rats with NAFLD can effectively improve the liver function and reduce the inflammatory responses.The liver protection effect is prominent.

KEY WORDSNonalcoholic fatty liver disease@Gekko gecko lipid metabolismLiver function inflammatory cytokines

【中圖分類號】R575.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.03.052

*河北省中醫(yī)藥管理局計劃項目(2015290)

△河北省河間市人民醫(yī)院(滄州 061001)