賈利寧　楊　陽(yáng)　高　明　馬曉桃　張星映　付榮國(guó)

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病科(西安 710004)

?

六味地黃湯聯(lián)合來(lái)氟米特、潑尼松治療大鼠IgA腎病的研究*

賈利寧楊陽(yáng)△高明▲馬曉桃張星映付榮國(guó)□

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病科(西安 710004)

摘要目的：探討六味地黃湯聯(lián)合來(lái)氟米特、潑尼松對(duì)大鼠IgA腎病的作用及其可能的機(jī)理。方法：第12周末造模成功后，隨機(jī)分為模型對(duì)照(M)組、來(lái)氟米特和潑尼松(LP)組和中藥(C)組、來(lái)氟米特、潑尼松聯(lián)合中藥(LPC)組和正常對(duì)照(K)組，檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白、尿紅細(xì)胞、腎功、血漿白蛋白。腎組織行HE、PAS、P+M及免疫熒光染色；RT-PCR檢測(cè)足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與其他組相比，LPC組尿蛋白、尿紅細(xì)胞明顯減少，血清BUN、SCr明顯下降，HE、PAS染色、P+M染色提示腎組織病理?yè)p害程度相對(duì)較輕，免疫熒光提示腎小球系膜區(qū)IgA沉積相對(duì)明顯減少，且腎組織nephrin、podocin mRNA表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：六味地黃湯聯(lián)合來(lái)氟米特、潑尼松能夠延緩腎臟損害的進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Nephrin、Podocin的表達(dá)，抑制系膜細(xì)胞增生，減少系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積有關(guān)。

主題詞腎病 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)大鼠

近年來(lái)，IgA腎病在原發(fā)性腎小球疾病中所占的比例升高，雖然IgA腎病進(jìn)展較為緩慢，但仍有15%～25%的患者在10年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病[1]。因此，控制IgA腎病的進(jìn)展、延緩終末期腎病的發(fā)生是腎臟疾病治療的主要目的。傳統(tǒng)的西藥對(duì)IgA腎病蛋白尿的治療停滯不前，因其嚴(yán)重的毒副作用使應(yīng)用受到一定限制[2-3]。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中藥的應(yīng)用越來(lái)越多，特別是中西醫(yī)結(jié)合治療IgA腎病是目前控制IgA腎病進(jìn)展的最佳方案[4-5]。本研究探討來(lái)氟米特、潑尼松聯(lián)合中藥六味地黃湯方案對(duì)大鼠IgA腎病的作用及其可能的機(jī)理。

1材料雌性健康SD大鼠42只，隨機(jī)分為正常對(duì)照(K)組和模型組，其中正常對(duì)照組7只，造模組35只，采用口服免疫原BSA(牛血清白蛋白)皮下注射四氯化碳，并聯(lián)合運(yùn)用LPS(脂多糖)尾靜脈注射制造IgA腎病模型[6]。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1藥物第12周末分別在正常對(duì)照組和造模組隨即選取大鼠處死，留取腎組織標(biāo)本，并初步驗(yàn)證造模成功后，剩余造模大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照(M)組、來(lái)氟米特+潑尼松(LP)組和中藥(C)組、來(lái)氟米特+潑尼松+中藥(LPC)組，并分別給予等量生理鹽水、來(lái)氟米特+潑尼松混懸液、中藥湯劑、來(lái)氟米特+潑尼松混懸液+中藥湯劑灌胃，潑尼松按3mg /kg/d給藥，來(lái)氟米特按10mg/kg/d給藥，中藥方劑在六味地黃湯基礎(chǔ)上加減化裁而成，組方包括：黃芪60g，丹參30g，生地、熟地各30g，山藥、山萸肉、丹皮、茯苓、澤瀉、枸杞子、菟絲子各12g，焦三仙(焦麥芽、焦山楂、焦神曲)各12g，二冬(天門(mén)冬、麥門(mén)冬)各12g，甘草6g。

2.2檢測(cè)項(xiàng)目定期收集大鼠尿標(biāo)本檢測(cè)尿紅細(xì)胞尿蛋白。第18周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，收集大鼠血標(biāo)本檢測(cè)腎功、血漿白蛋白，取腎組織液氮處理后置于-80℃冰箱保存，分別做普通光鏡HE、PAS染色、P+M染色及免疫熒光染色和RT-PCR檢查。普通光鏡下觀察病理情況，免疫熒光染色觀察腎小球系膜區(qū)IgA沉積情況，RT-PCR檢查腎臟足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA(NPHS1、NPHS2)表達(dá)。Nephrin(NPHS1)和podocin(NPHS2)引物設(shè)計(jì)與合成據(jù)Genebank查詢(xún)結(jié)果得到，序列如下：Sequence Name:NPHS1(230bp)； Forward Primer: 5-GCGTCAGCATCAGCAGCAAC-3； Reverse Primer: 5-CAGCACATTGAAGCGGTAGAAGG-3。(2)Sequence Name:NPHS2(167bp)； Forward Primer: 5-GGATGGCGGCTGAGATTCTGTC-3； Reverse Primer: 5-GATGCTTCCTTGTGCTCTGTTGC-3。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各檢測(cè)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法，數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P<0.05認(rèn)為數(shù)據(jù)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果3.1 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)第12周末，隨機(jī)抽取的造模大鼠24小時(shí)尿蛋白(38.70±2.74 mg)明顯高于正常對(duì)照組(2.88±2.09 mg)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疫熒光示造模組各大鼠大部分腎小球系膜區(qū)IgA團(tuán)塊狀沉積，而正常對(duì)照組未見(jiàn)上述改變，進(jìn)一步驗(yàn)證造模成功。

3.2治療后各組24小時(shí)尿蛋白定量、血尿的變化經(jīng)治療6周后，與M組比較，尿蛋白、尿紅細(xì)胞在各治療組均有下降，除 C組治療效果稍差，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與其余各組比較，LPC組尿蛋白下降最為明顯(P<0.05)，但LPC組尿紅細(xì)胞與LP組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LP組與C組之間比較，LP組較C組效果更明顯，兩指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3.3各組血漿白蛋白、尿素氮、肌酐的變化經(jīng)治療6周后，與M組相比，其余各組血漿白蛋白升高，尿素氮、血肌酐下降，其中C組治療效果稍差，與M組比較除尿素氮有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P<0.05)，其余兩指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPC組與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見(jiàn)表2。

3.4RT-PCR檢測(cè)腎組織Nephrin和Podocin的表達(dá)將PCR產(chǎn)物帶用凝膠圖像處理軟件進(jìn)行條帶半定量分析，轉(zhuǎn)化成數(shù)值型變量。以GADPH為內(nèi)參，NPHS1/GADPH、NPHS2/GADPH計(jì)算nephrin和podocin的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，如下表3。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組比兩單藥使用，具有更明顯的上調(diào)nephrin、podocin mRNA的作用(p<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1各組大鼠腎組織Nephrin和Podocin mRNA表達(dá)

3.5各組大鼠腎臟病理學(xué)檢測(cè)①HE染色M組可見(jiàn)系膜細(xì)胞及基質(zhì)中度增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球基底膜增厚，小血管硬化，管腔變窄，C組病變較M組稍輕，LP組及LPC組病理?yè)p傷程度明顯減輕，系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生，LPC組療效最佳，空白對(duì)照組未見(jiàn)上述明顯變化，見(jiàn)圖2。

②PAS染色 M組看見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)明顯增生，腎小球體積輕度增大，部分球囊粘連，C組病理?yè)p害稍輕，LP組和LPC組較前兩組明顯好轉(zhuǎn)，腎小球增生程度減輕，腎小球基底膜完整，其中LPC組病理?yè)p害最輕。正常腎小球未見(jiàn)上述變化，見(jiàn)圖3。

③ P+M染色M組看見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)明顯增生，腎小球腫脹，可見(jiàn)上皮下嗜復(fù)紅蛋白沉積，C組病理?yè)p害稍輕，LP組和LPC組較前兩組明顯好轉(zhuǎn)，腎小球增生程度減輕，腎小球基底膜完整，未見(jiàn)嗜復(fù)紅沉積物，其中LPC組病理?yè)p害最輕。正常腎小球未見(jiàn)上述變化，見(jiàn)圖4。

④IgA免疫熒光強(qiáng)度比較：M組腎小球系膜區(qū)可見(jiàn)免疫熒光團(tuán)塊樣沉積，C組較M組稍弱，LP及LPC組熒光較暗，強(qiáng)度較弱，正常對(duì)照組無(wú)或僅有少量免疫復(fù)合物沉積，并對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。M組與正常組有顯著差異，LP組與模型組比較有顯著差異，LPC組與模型組、C組有顯著差異。見(jiàn)表4。

注：(-)表示陰性；(±)表示高倍鏡下似乎可見(jiàn)；(+)表示低倍鏡下似乎可見(jiàn)，高倍鏡下明顯可見(jiàn)；(++)表示低倍鏡下明顯可見(jiàn)，高倍鏡下清晰可見(jiàn)；(+++)表示低倍鏡下清晰可見(jiàn)，高倍鏡下耀眼；(++++)表示低倍鏡下耀眼，高倍鏡下不刺眼。

4討論自IgA腎病發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)其研究越來(lái)越多，但至今本病的發(fā)病機(jī)制仍不甚清楚。IgA腎病臨床表現(xiàn)多樣，病理類(lèi)型復(fù)雜，治療存在諸多困難?，F(xiàn)有的研究表明激素能夠減輕蛋白尿，減少發(fā)展至終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)，但其對(duì)腎臟的保護(hù)作用還不是很清楚[7-8]。意大利的一組調(diào)查研究顯示，激素有10年的后續(xù)治療效果，可明顯減輕尿蛋白，延緩腎臟病的進(jìn)展[9]。然而大劑量激素可能導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。而最新隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，激素僅能適度減輕蛋白尿，并不能保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)率[10-11]。我們通常認(rèn)為，尿蛋白量>1g/24h的患者需使用糖皮質(zhì)激素，加用大劑量ACEI/ARB控制血壓，保護(hù)腎臟功能[12]。國(guó)內(nèi)張虹等[13]選取31例原發(fā)性IgA腎病患者，用來(lái)氟米特聯(lián)合小劑量激素進(jìn)行治療，療程3個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為單純發(fā)作性血尿和鏡下血尿，病理積分較少者療效較好，對(duì)于臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿或腎病綜合征者療效較差，治療過(guò)程中有4例出現(xiàn)來(lái)氟米特相關(guān)副作用。因此，我們需一種藥物，能夠減輕激素及其他免疫抑制劑的毒副作用，并能進(jìn)一步加強(qiáng)其治療作用，而我們的中藥方劑就是此類(lèi)藥物之一。陳淑娟等[14]發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)合替米沙坦治療IgA腎病療效顯著，改善患者臨床癥狀，保護(hù)腎功能，延緩IgA腎病的進(jìn)展。IgA腎病多以氣陰兩虛者多見(jiàn)，蛋白尿的發(fā)生多數(shù)以肝腎陰虛為常見(jiàn)癥候群。六味地黃湯具有益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎、清熱涼血等功效，其治療腎臟疾病歷史悠久，本方劑是在六味地黃湯基礎(chǔ)上加減多味中藥而成，對(duì)氣陰兩虛、肝腎陰虛者，尤為有效。近年來(lái)六味地黃湯對(duì)糖尿病腎病大鼠治療效果文獻(xiàn)報(bào)道較多，但對(duì)IgA腎病的作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)行嚴(yán)格的對(duì)比觀察，證明了六味地黃湯在治療IgA腎病上的功效[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)中藥組雖然能減輕蛋白尿，減少系膜區(qū)IgA沉積，穩(wěn)定腎功能，但與模型組相比除尿素氮外其余各項(xiàng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示其單獨(dú)使用中藥六味地黃湯對(duì)IgA腎病的治療作用較弱。但來(lái)氟米特、潑尼松聯(lián)合中藥六味地黃湯能夠明顯降低IgA腎病大鼠蛋白尿，改善腎功能，認(rèn)為IgA腎病的發(fā)病可能與nephrin、podocin分子表達(dá)異常導(dǎo)致腎臟濾過(guò)屏障損傷，尿蛋白產(chǎn)生、腎功能損害關(guān)系密切[16-17]。從病理上，我們觀察到LPC組除系膜細(xì)胞增生減輕，系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積減少外，同時(shí)腎小球毛細(xì)血管管壁與血管周徑之比明顯小于LP組，其機(jī)制可能與中藥具有保護(hù)內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化等有關(guān)。中藥方劑中所含的黃芪、丹參等中藥可以減少內(nèi)皮細(xì)胞釋放血漿血栓素、內(nèi)皮素和一氧化氮，提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率及SOD活性，降低乳酸脫氫酶活性等，達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，還可以通過(guò)抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，抗脂蛋白的氧化，抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1，對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞凋亡，抑制平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因c-myc表達(dá)等作用[18-19]。

綜合分析，潑尼松、來(lái)氟米特聯(lián)合中藥六味地黃湯通過(guò)不同靶點(diǎn)藥物的協(xié)同作用，達(dá)到更好的治療IgA腎病的效果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生嚴(yán)重的不良作用?？赡転榕R床中西醫(yī)聯(lián)合治療IgA腎病提供理論依據(jù)，并為其他免疫抑制劑聯(lián)合中藥治療IgA腎病的研究提供一定的啟發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1]Le W, Liang S, Hu Y, Deng K, et al. Long-term renal survival and related risk factors in patients with IgA nephropathy: results from a cohort of 1155 cases in a Chinese adult population. Nephrol Dial Transplant,2012,27(4):1479-1485.

[2]Tesar V, Troyanov S, Bellur S, et al. Corticosteroids in IgA Nephropathy: A Retrospective Analysis from the VALIGA Study. J Am Soc Nephrol,2015, 2(12):712-720.

[3]ZhangG Q, Shi SF, Zhu L, et al. Tacrolimus improves the proteinuria remission in patients with refractory IgA nephropathy [J]. American journal of nephrology,2012, 35(4):312-320.

[4]徐明中，胡偉新，劉志紅，等.雷公藤多甙聯(lián)合苯那普利和大黃素治療IgA腎病的前瞻性臨床研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志, 2004,13(1):19-24.

[5]范德墉，葉朝陽(yáng)，戎殳，等.中等量蛋白尿IgA腎病糖皮質(zhì)激素與雷公藤治療對(duì)比觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008,9(1):45-46.

[6]湯穎,婁探奇.試驗(yàn)性IgA腎病模型的改進(jìn)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào).2006,27(27):184-187.

[7]Lv JC, Xu D, Perkovic V, et al. Corticosteroid therapy in IgA nephropathy [J]. J Am Soc Nephrol, 2012, 23(6):1108-1116.

[8]傅強(qiáng)，王志宏，郭偉峰.來(lái)氟米特聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療IgA腎病23例療效觀察[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009, 38 (3): 351-353.

[9]Manno C, Torres DD, Rossini M, et al. Randomized controlled clinical trial of corticosteroids plus ACE-inhibitors with long-term follow-up in proteinuric IgA nephropathy [J]. Nephrol Dial Transplant,2009, 24(12):3694-3701.

[10]Liu H, Xu X, Fang Y, et al. Comparison of glucocorticoids alone and combined with cyclosporine a in patients with IgA nephropathy: a prospective randomized controlled trial [J]. Internal medicine (Tokyo, Japan),2014, 53(7):675-681.

[11]Katafuchi R, Ikeda K, Mizumasa T, et al. Controlled, prospective trial of steroid treatment in IgA nephropathy: a limitation of low-dose prednisolone therapy [J]. Am J Kidney Dis,2003, 41(5):972-983.

[12]Kawamura T, Yoshimura M, Miyazaki Y, et al. A multicenter randomized controlled trial of tonsillectomy combined with steroid pulse therapy in patients with immunoglobulin A nephropathy [J]. Nephrol Dial Transplant,2014,29(8):1546-1553.

[13] 張虹,朱啟之.來(lái)氟米特合并小劑量激素治療IgA腎病31例臨床觀察[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006,22(9): 1056-1057.

[14] 陳淑娟，羅仁.益氣養(yǎng)陰涼血法聯(lián)合替米沙坦治療原發(fā)性IgA腎病的效果[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014,10(35):2012-2015.

[15] 謝謀華,王建軍.六味地黃湯在腎臟病治療上的應(yīng)用[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(9):1318.

[16] Bao H, Hu S, Zhang C, Shi S, Qin W, Zeng C et al. Inhibition of miRNA-21 prevents fibrogenic activation in podocytes and tubular cells in IgA nephropathy. Biochemical and biophysical research communications,2014, 444(4):455-460.

[17] Kodama F, Asamuma K, Takagi M, et al. Translocation of dendrin to the podocyte nucleus in acute glomerular injury in patients with IgA nephropathy [J]. Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(7):1762-1772.

[18] Zhang C, Zeng X, Li Z, Wang Z, Li S. Immunoglobulin A nephropathy: current progress and future directions. Transl Res,2015, 3(4):82-91.

[19] Manno C, Torres DD, Rossini M, Pesce F, Schena FP. Randomized controlled clinical trial of corticosteroids plus ACE-inhibitors with long-term follow-up in proteinuric IgA nephropathy. Nephrol Dial Transplant,2009, 24(12):3694-3701.

(收稿2015-11-23；修回2015-12-25)

通訊作者□

【中圖分類(lèi)號(hào)】R573

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.03.051

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015JM8429)

△延安大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(延安 716000)

▲西安市第四醫(yī)院腎內(nèi)科(西安 710004)