梁延琛,李念虎,丁英杰,叢海波

(1山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南250021；2山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3威海市中心醫(yī)院)

?

補腎活血方對骨關節(jié)炎大鼠關節(jié)滑液IL-1β水平及滑膜MMP-9 mRNA表達的影響

梁延琛1,2,李念虎2,丁英杰3,叢海波3

(1山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，濟南250021；2山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3威海市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察補腎活血方對骨關節(jié)炎(OA)大鼠關節(jié)滑液白細胞介素1β(IL-1β)及關節(jié)滑膜基質金屬蛋白酶9(MMP-9)表達的影響。方法 取20只采用Hulth法OA造模成功的SD大鼠，隨機分為觀察組和對照組各10只，分別給予自擬補腎活血方制劑、等量淀粉混懸液灌胃6周。采用酶免疫分析(RIA)法檢測關節(jié)滑液中的IL-1β，采用RT-PCR法檢測關節(jié)滑膜中的MMP-9 mRNA。結果觀察組和對照組關節(jié)滑液IL-1β水平分別為(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,關節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達量分別為0.31±0.05、0.68±0.03。觀察組大鼠關節(jié)滑液IL-1β水平和關節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達量均低于對照組，P均<0.05。結論 補腎活血方灌胃可以抑制OA大鼠關節(jié)滑膜細胞分泌IL-1β及關節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達。

關鍵詞：補腎活血方；骨關節(jié)炎；白細胞介素1β；基質金屬蛋白酶9

骨關節(jié)炎(OA)是一種慢性、漸進性、退行性的關節(jié)病變，以膝關節(jié)OA的發(fā)病率最高。其主要病理學特征是關節(jié)軟骨變性破壞、軟骨下骨硬化、關節(jié)表面骨贅形成、滑膜增生、關節(jié)間隙變窄等。OA的病因復雜，發(fā)病機制尚不清楚，目前認為其是在生物學和力學因素共同作用下導致的軟骨細胞、軟骨下骨及細胞外基質三者合成和降解穩(wěn)態(tài)失衡的退行性關節(jié)疾病。補腎活血方是我院李念虎教授自擬的一種治療OA的方劑，臨床應用有效[1,2],但作用機制不明。2015年3～5月，我們觀察了補腎活血方對OA大鼠關節(jié)滑液IL-1β水平和關節(jié)滑膜基質金屬蛋白酶9(MMP-9)基因表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1動物模型制作SPF級SD 大鼠26只，鼠齡3個月，未孕，雌雄各半，體質量(220±20)g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。采用Hulth法[3]行OA造模。取大鼠后肢膝關節(jié)內側縱行手術入路，切斷前后交叉韌帶、內側副韌帶，切除內側半月板，術中避免損傷關節(jié)軟骨。術后每鼠每天肌注青霉素鈉預防術后感染。術后第3天開始強迫大鼠每天早晚活動1次，每次時長為半小時，連續(xù)6周。普通飼料喂養(yǎng)。隨機抽取3只處死，解剖下肢膝關節(jié)，取股骨遠端、脛骨近端關節(jié)面行形態(tài)學檢測。肉眼觀察見股骨遠端、脛骨近端關節(jié)面均表面粗糙，欠規(guī)整。再對切取的關節(jié)面行HE染色，光學顯微鏡下見關節(jié)軟骨表面變薄，軟骨細胞減少，呈退行性改變；軟骨下骨小梁變細，排列紊亂，連續(xù)性差；滑膜增生肥厚。肉眼及光學顯微鏡觀察均證實OA造模成功。

1.2分組與處理從剩余OA造模成功大鼠中選取20只，隨機分為觀察組和對照組各10只，分別給予自擬補腎活血方制劑6 mL和等量淀粉混懸液，每天早晚各灌胃1次，連續(xù)給藥6周。其間大鼠正常飼養(yǎng)，不再強迫其活動。補腎活血方由熟地黃、附子、丹參、巴戟天、仙茅等中藥組成。

1.3關節(jié)滑液IL-1β檢測在兩組大鼠一側后肢膝關節(jié)內注入無菌生理鹽水0.2 mL，混勻后抽取關節(jié)液，用酶免疫分析法(RIA)檢測IL-1β。每份標本至少檢測3次，取平均值。

1.4關節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達檢測取兩組大鼠另一側后膝關節(jié)滑膜。采用TRIzol法提取滑膜組織RNA，瓊脂糖電泳進行純度檢測。用反轉錄-多聚酶鏈反應法(RT-PCR)檢測關節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達，操作按試劑盒說明書進行，結果以目的條帶與β-actin條帶的灰度值之比表示。

2結果

觀察組和對照組關節(jié)滑液IL-1β水平分別為(2.25±0.13)、(5.37±0.68)pg/mL,關節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達量分別為0.31±0.05、0.68±0.03。觀察組大鼠關節(jié)滑液IL-1β水平和關節(jié)滑膜MMP-9 mRNA表達量均低于對照組，P均<0.05。

3討論

OA屬于祖國醫(yī)學中“痹癥”、“骨痹”范疇。中醫(yī)骨傷科學認為，OA發(fā)病機制是腎虛為本，血瘀為標，本虛標實，本痿標痹。肝藏血、主筋，腎藏精、主骨，肝腎虧虛，精血不足，則致筋骨失養(yǎng)，經脈閉阻，不通則痛，易感風寒濕邪而發(fā)為“痹”?！端貑枴け哉撈吩疲骸肮潜哉?，肝腎虧虛，化生不足，因虛邪之風，寒濕邪至，兩虛相得，乃客其形”，認為骨痹是肝腎虧虛致正氣不足，風寒濕邪乘虛而入，正邪相搏，經絡痹阻，是其主要的發(fā)病機制?！稄埵厢t(yī)通》曰：“膝者，筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風寒濕氣襲之?！闭J為骨痹的主要內因是肝腎虧虛，風寒濕邪是其發(fā)病的重要外因。祖國醫(yī)學歷代名家及典籍基本上一致認可本病本虛標實的病機，不同主要是在其中醫(yī)癥候方面，有重于肝而有重于腎者，有重于瘀而有重于邪者[4]。

針對“骨痹”發(fā)病機制，李念虎教授結合古籍及多年臨床實踐，重視OA“本虛標實，本痿標痹”的特點，自擬補腎活血方，并在多年臨床實踐中取得了滿意的療效。此方中，熟地黃滋陰補血、益精填髓，附子回陽救逆、散寒止痛，二者共為君藥；丹參活血消癰、祛瘀止痛，為臣藥；巴戟天補腎助陽、祛風除濕；仙茅溫腎壯陽、驅寒除濕，共為佐藥。此補腎活血方藥味不在多而在精，藥效重在標本兼治，補腎兼以強筋，活血而不破血，從而達到治療OA的目的。

近年來國內外研究證實[5]，細胞因子在OA發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起著重要作用，其中IL-1及TNF-α是關節(jié)炎病理過程中促進軟骨基質降解和關節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子[6]。IL-1β在OA發(fā)生的病理生理過程中處于核心地位[7]，可以發(fā)揮以下作用：①改變軟骨細胞的正常結構和功能，促進軟骨細胞非正常性的凋亡；②改變軟骨基質中膠原蛋白的含量，減少Ⅱ型膠原蛋白的合成，并降低Ⅱ型膠原蛋白的基因表達，使其易于被基質金屬蛋白酶(MMPs)降解；③通過誘導MMPs的高表達和活性增加，促進軟骨基質中膠原蛋白的降解[8]；④可以激發(fā)關節(jié)滑膜中炎性介質的高合成及高表達，促使關節(jié)內微環(huán)境的炎癥反應加重。

MMPs是一組Zn2+、Ca2+依賴的蛋白水解酶，其結構具有高度同源性，均由10個外顯子和9個內含子組成，在中性pH條件下能水解包括膠原蛋白、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白等在內的絕大部分細胞外基質[9]。MMP-9屬于 MMPs中的明膠酶亞型，具有降解膠原蛋白明膠、彈性蛋白的高度特異的能力。在OA的演進過程中，MMP-9可加快軟骨基質中膠原蛋白、彈性蛋白的降解速度，致使以Ⅱ型膠原蛋白為主體的軟骨基質網狀框架結構大量破壞，關節(jié)軟骨腫脹，抵抗外力作用下降，最終導致關節(jié)軟骨出現(xiàn)不可逆的永久性破壞[10]。

本研究結果證實，補腎活血方可降低OA關節(jié)滑液中IL-1β的水平，同時使關節(jié)滑膜中MMP-9 mRNA表達明顯減少。其可能機制是補腎活血方采用補腎法上調性激素水平，提高超氧化物歧化酶活性，清除氧自由基，從而促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡，減緩軟骨細胞退行性變；活血法改善微循環(huán)，降低骨內壓，抑制滑膜中炎癥反應，促進關節(jié)軟骨修補；兩者有機地結合為一個統(tǒng)一的整體，最終針對OA的發(fā)病機制，調節(jié)異常變化的細胞因子的水平，抑制基質金屬蛋白酶含量和活性的異常增高，從而達到治療OA的目的。

參考文獻：

[1] Li NH. Clinical observation of bushen huoxue formula treating early osteoarthritis of the knee[J].J Tradit Chin Orthoped Traumatol, 2006,18(10):11-12.

[2] Li NH. Effects of serum containing Bushen Huoxue drugs on level of TNF-α and IL-1β of synovioctye[J]. China J Orthopaed Traumatol, 2007,20(5):302-303.

[3] Rogart JN, Barrach HJ, Chichester CO. Articular collagen degradation in the hulth-telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 1999,7(6):539-547.

[4] Li NH. Review of differential treatment of osteoarthritis of the knee[J]. Shandong J Tradit Chin Med, 2005,24(5):331-334.

[5] Chikanza I, Fernandes L. Novel strategies for the treatment of osteoarthritis[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2000,9(7):1499.

[6] Sandra K, Leo AB, Alison MB, et al. Different roles of tumour necrosis factor-α and interleukin-1 in murine streptococcal cell wall arthritis[J]. Cytokine, 1998,10(5):690-702.

[7] Blom AB, van der Kraan PM, van der Berg WB. Cytokine targeting in osteoarthritis[J]. Curr Drug Targets, 2007,8(2):283-292.

[8] Gupta S. A decision between life and death during TNF-α induced signaling[J]. J Clin Immunol, 2002,22(4):185-194.

[9] 董剛,周輝. 金屬蛋白酶在骨關節(jié)炎軟骨內環(huán)境中的表達與調控[J]. 中國骨傷,2009,22(2):156.

[10] Bassiouni HM, Deeb M, Kenawy N, et al. Phonoarthorgraphy, musculoskeletal ultrasonography and biochemical biomarkers for the evaluation of keen cartilage in osteoarthritis[J]. Mod Rheumatal, 2011,21(5):500-508.

(收稿日期：2015-10-12)

中圖分類號：684.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)06-0036-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.012

通信作者：叢海波(E-mail: haibocong@163.com)

基金項目：山東省自然科學基金資助項目(2009ZRA01218)。