張有辰，許春花，池永學(xué)，金正勇

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133000)

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IGF-Ⅰ腹腔注射對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的防治作用

張有辰，許春花，池永學(xué)，金正勇

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133000)

目的觀察胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)腹腔注射對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并探討其機(jī)制。方法將30只新生Wistar大鼠隨機(jī)分為空氣組、高氧組、干預(yù)組，每組10只新生。高氧組、干預(yù)組制備高氧肺損傷模型，空氣組和高氧組、干預(yù)組從造模第1天起分別腹腔注射生理鹽水和重組IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，連續(xù)7 d，計(jì)算各組肺組織干濕重比(W/D)，計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)，對(duì)BALF中的細(xì)胞進(jìn)行Diff-Quik染色，HE染色觀察肺組織病理，核染色結(jié)合TUNEL觀察肺細(xì)胞凋亡情況，Western blotting法檢測(cè)肺組織GRP78、CHOP蛋白。結(jié)果干預(yù)組、高氧組、空氣組大鼠肺組織W/D分別為5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，BALF中白細(xì)胞總數(shù)分別為(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。肺組織病理切片觀察可見(jiàn)干預(yù)組較高氧組肺水腫減輕。干預(yù)組、高氧組、空氣組新生大鼠肺細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。干預(yù)組、高氧組、空氣組大鼠肺組織GRP78分別為0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分別為1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。結(jié)論IGF-Ⅰ腹腔注射對(duì)新生大鼠高氧肺損傷有防治作用，其機(jī)制可能為下調(diào)CHOP、GRP78蛋白表達(dá)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ；高氧肺損傷；GRP78蛋白；CHOP蛋白

隨著我國(guó)近幾年新生兒搶救水平的不斷提高，新生兒的生存率明顯增加，常用于早產(chǎn)兒搶救治療中的氧療所導(dǎo)致的肺損傷發(fā)生率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，并成為降低新生兒生存率的重要因素之一。研究[1]發(fā)現(xiàn)，高氧誘導(dǎo)后新生大鼠肺細(xì)胞凋亡增加，且隨著高氧時(shí)間延長(zhǎng)其細(xì)胞凋亡程度逐漸加重，認(rèn)為肺細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致支氣管肺發(fā)育不良(BPD)的重要原因。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是胰島素生長(zhǎng)因子家族成員之一，是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈堿性蛋白，是在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用的生長(zhǎng)因子[2]。研究[3,4]報(bào)道，IGF-Ⅰ通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞DNA合成和代謝，促使細(xì)胞進(jìn)入G1期，從而有利于細(xì)胞增殖，同時(shí)通過(guò)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)途徑的交叉作用抑制各種細(xì)胞凋亡。2013年9月～2016年1月，本研究觀察了IGF-Ⅰ腹腔注射對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 新生Wistar大鼠30只，體質(zhì)量7～10 g，購(gòu)自延邊大學(xué)動(dòng)物科，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(吉)2007-0011)。重組IGF-Ⅰ(Sigma公司)，CHOP抗體(Santa cruz公司)，GRP78抗體(Santa cruz公司)，SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(Solarbio公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)，Diff-Quik染色試劑盒(深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)。

1.2高氧肺損傷模型的制備將30只新生大鼠隨機(jī)分為空氣組、高氧組、干預(yù)組，每組10只。將高氧組與干預(yù)組新生大鼠置于玻璃箱內(nèi)，持續(xù)吸入氧氣，氧濃度為85%以上，空氣組在同一室內(nèi)吸常壓空氣，玻璃箱與室內(nèi)溫度為25～26 ℃，濕度為60%～70%?？諝饨M和高氧組、干預(yù)組從造模第1天起分別腹腔注射生理鹽水和重組IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，連續(xù)7 d。

1.3觀察方法制備模型第7天，各組進(jìn)行下列操作。 ①肺組織干濕重比(W/D)計(jì)算：新生大鼠10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，剪開(kāi)胸腔，充分暴露肺組織，分離氣管和肺組織，結(jié)扎右支氣管，取下結(jié)扎的右肺，擦干肺組織表面，稱(chēng)重后記錄肺濕重，置于80 ℃烤箱內(nèi)，每天稱(chēng)重1次，直至連續(xù)2 d重量無(wú)明顯變化，后置于37 ℃烤箱內(nèi)，記錄肺干重，計(jì)算肺W/D。 ②支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)：新生大鼠麻醉后，沿正中線切開(kāi)頸胸部，并剝離氣管周?chē)募〗M織，充分暴露氣管頸段并切開(kāi)，將細(xì)靜脈管插入氣管中，注入1 mL的生理鹽水溶液，然后反復(fù)回抽3次，取得BALF。將BALF在1 300 r/min、4 ℃下離心10 min，去除上層液，余下細(xì)胞用適量的生理鹽水溶液反復(fù)吹打懸浮，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)。 ③BALF中細(xì)胞Diff-Quik染色：載玻片上涂抹BALF的細(xì)胞，嚴(yán)格按Diff-Quik染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在100倍光學(xué)纖維鏡下，每組隨機(jī)抽取細(xì)胞涂片，取10個(gè)視野記錄每平方毫米內(nèi)的細(xì)胞數(shù)(N/mm2)，并在100倍的倍率下攝影。④肺組織病理：新生鼠處死后，肺組織用4%多聚甲醛灌注固定20 min，再浸入4%多聚甲醛外固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟包埋，超薄切片，作HE染色,每組大鼠各做一張切片。觀察各組肺泡發(fā)育和損傷程度。⑤肺細(xì)胞凋亡情況：將肺組織包埋切片，做核染色結(jié)合TUNEL觀察各組肺細(xì)胞凋亡情況，熒光顯微鏡下觀察各組凋亡細(xì)胞。每張切片記錄500個(gè)肺泡細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示肺細(xì)胞凋亡指數(shù)。⑥肺組織GRP78、CHOP蛋白檢測(cè)：采用Western blotting法。組織標(biāo)本離體后浸泡于液氮中速凍，后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存。常規(guī)勻漿、離心制備組織蛋白抽提液,提取上樣8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳,半干式轉(zhuǎn)膜(PVDF膜),300 mA恒流40 min。封閉液封閉后PVDF膜過(guò)夜,TBS-T緩沖液中充分振蕩清洗,分別滴加一、二抗,一、二抗終濃度稀釋比例為1∶2 000,ECM顯色。X光片曝光后顯影、定影、晾干。用凝膠成像系統(tǒng)定量分析結(jié)果，用Image J軟件測(cè)定灰度值，將與β-actin條帶灰度值的比值作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

干預(yù)組、高氧組、空氣組大鼠肺組織W/D分別為5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。干預(yù)組、高氧組、空氣組BALF中白細(xì)胞總數(shù)分別為(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P<0.05或<0.01。肺組織病理切片觀察可見(jiàn)，空氣組肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無(wú)水腫，較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；高氧組肺內(nèi)小血管擴(kuò)張充血，血管壁及小支氣管壁水腫，偶見(jiàn)少量纖維組織增生，肺泡腔及小氣道周?chē)梢?jiàn)少量炎癥細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主；干預(yù)組與高氧組相比，炎癥細(xì)胞明顯減少，肺水腫減輕?？諝饨M肺組織中可見(jiàn)少量細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞以肺泡上皮細(xì)胞、小氣道上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞為主?？諝饨M肺細(xì)胞DAPI染色，熒光顯微鏡下核呈均勻的藍(lán)色；高氧組凋亡的肺細(xì)胞核呈凝聚的亮白色，肺細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)亮白色的凋亡小體，TUNEL熒光染色中正常的細(xì)胞核不著色，凋亡的細(xì)胞核呈綠色圓形小體。干預(yù)組、高氧組、空氣組新生大鼠肺細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。干預(yù)組、高氧組、空氣組大鼠肺組織GRP78分別為0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分別為1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧組與空氣組相比，干預(yù)組與高氧組相比，P均<0.05。

3　討論

極低出生體重兒出生后肺發(fā)育尚未成熟，需長(zhǎng)期暴露于高氧環(huán)境中。長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧可引起B(yǎng)PD。有研究[5]報(bào)道，長(zhǎng)期暴露在高氧中新生大鼠肺損傷的發(fā)生與人類(lèi)新生兒BPD類(lèi)似，BPD的病理過(guò)程已被公認(rèn)為早期肺水腫及晚期肺間質(zhì)纖維化、肺泡發(fā)育障礙。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，ERS與高氧肺損傷的關(guān)系日益受到關(guān)注。研究[6～8]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)氧化可影響蛋白質(zhì)的正確折疊，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，UPR經(jīng)其膜上的PERK、IRE1及ATF6等3個(gè)跨膜蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)而發(fā)生反應(yīng)。CHOP是一個(gè)ERS應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)引起凋亡。ERS的標(biāo)志性分子GRP78在ERS中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞的一種重要的防御機(jī)制。IGF-Ⅰ作為體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子在組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。孕15周時(shí)胎兒體內(nèi)可以檢測(cè)到IGF-Ⅰ，胰島素生長(zhǎng)因子對(duì)胎兒的作用機(jī)理尚不十分清楚，但其在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育方面的作用已得到人們普遍認(rèn)同。在肺發(fā)育的各個(gè)階段中IGF-Ⅰ mRNA均有表達(dá)，表明IGF-Ⅰ是在肺生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用的生長(zhǎng)因子[9]。研究[10]表明，高氧肺損傷后第3、7天，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅰ受體、IGF-Ⅱ表達(dá)均增高，且對(duì)高氧損傷后的修復(fù)有重要意義。生后7 d新生大鼠肺的發(fā)育與新生兒出生時(shí)相似[11]，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠高氧肺損傷模型[12]，此模型研究已得到廣泛利用與肯定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度氧可引起大鼠肺組織W/D明顯增加，誘發(fā)肺水腫。高氧可引起B(yǎng)ALF中白細(xì)胞增高，引起肺組織損傷并加重肺細(xì)胞凋亡。IGF-Ⅰ能減輕高氧誘導(dǎo)引起的肺水腫及炎癥，并對(duì)高氧肺細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用，這與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高氧可導(dǎo)致大鼠肺組織GRP78、CHOP蛋白表達(dá)升高，IGF-Ⅰ能下調(diào)其表達(dá)。

綜上所述，IGF-Ⅰ腹腔注射對(duì)新生大鼠高氧肺損傷有防治作用，其機(jī)制可能為下調(diào)CHOP、GRP78蛋白表達(dá)。

[1] Jobe AH. The new bronchopulmonary dysplasia[J]. Curr Opin Pediatr, 2011,23(2):167-172.

[2] 錢(qián)禎,周倩,王凱.胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中的作用[J].生殖與避孕,2014,34(3):227-231.

[3] 史琳琳,趙鋒,高學(xué)軍,等.催乳復(fù)合物、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中AKT-1和mTOR表達(dá)的作用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(3):23-27.

[4] 郭玲,王敏,郝亮.胰島素樣生長(zhǎng)因子1對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(33):6095-6098.

[5] 金梅花,金正勇.乳糖酸阿奇霉素對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的影響[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2015,38(3):187-189.

[6] 王洪巖,劉曉珺,杜雅菊,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝臟疾病研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2012,17(6):451-459.

[7] 劉友平,嚴(yán)冬梅,陳川寧,等.PI3K/Akt調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)GRP78的誘導(dǎo)[J].中國(guó)病理生理雜志,2011,27(4):749-754.

[8] 李劍,羅子國(guó).CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡中的作用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(2):208-211.

[9] 曾永芬,黃義德.胰島素樣生長(zhǎng)因子1及其在組織和器官生長(zhǎng)發(fā)育中的作用[J].生命科學(xué)研究,2015,19(2):165-168，184.

[10] Kim TH, Chow YH, Gill SE, et al. Effect of insulin-like growth factor blockade on hyperoxia-induced lung injury[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012,47(3):372-378.

[11] 許春花,金正勇.雌激素對(duì)新生大鼠高氧肺損傷的影響[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2011,34(2):89-92.

[12] 蘇立明,池永學(xué),金正勇,等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)哮喘模型小鼠肺部炎癥改變及細(xì)胞因子的影響[J].中國(guó)婦幼保健,2015,30(12):1927-1930.

[13] 金貞愛(ài),趙以坤,金正勇,等.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)高氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2013,15(6):490-493.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO81160083)。

金正勇(E-mail： jinzhengyong2003@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.011

R364

A

1002-266X(2016)23-0036-03

2016-01-04)