韋正樹(shù)，吳明貴，黃林，范永毅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西柳州 545005)

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前列腺癌組織中HPV16/18 DNA表達(dá)變化及其意義

韋正樹(shù)，吳明貴，黃林，范永毅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西柳州 545005)

目的觀察前列腺癌(PCa)組織中人乳頭瘤病毒(HPV)16/18 DNA表達(dá)情況，并探討其意義。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)技術(shù)檢測(cè)60例PCa患者(PCa組)、55例前列腺增生(BPH)患者(BPH組)前列腺組織中的HPV16、18 DNA,并觀察HPV16/18陽(yáng)性表達(dá)與PCa臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 PCa、BPH組HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.7%(22/60)、9.0%(5/55)，兩組比較，P<0.01。T1期+T2期、T3期+T4期臨床分期PCa患者前列腺組織中HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為21.4%、50.0%，兩者比較，P<0.05。結(jié)論 Pca患者前列腺組織中HPV16/18陽(yáng)性率高，HPV16/18表達(dá)與腫瘤臨床分期有關(guān)。

前列腺癌；人乳頭狀瘤病毒；聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向點(diǎn)雜交技術(shù)

人乳頭瘤病毒(HPV)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，高危型HPV16、18的持續(xù)感染及多重感染是導(dǎo)致宮頸癌變的主要原因[1,2]。在解剖結(jié)構(gòu)上，前列腺與子宮頸相似，有學(xué)者猜測(cè)HPV感染在前列腺癌(PCa)的發(fā)病機(jī)制中可能扮演著重要角色[3,4]。因此，本研究觀察了HPV16/18在PCa組織中的表達(dá)情況，并探討其意義。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源所有標(biāo)本均取自2012～2014年廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院接受B超引導(dǎo)下經(jīng)會(huì)陰前列腺穿刺術(shù)、經(jīng)尿道前列腺等離子汽化電切術(shù)治療的患者。PCa患者60例(PCa組)，年齡53～88(71.1±6.6)歲，術(shù)前均未接受放療、化療、抗雄激素或手術(shù)去勢(shì)治療。前列腺增生(BPH)患者55例(BPH組)，年齡58～85(72.6±8.1)歲。兩組一般資料具有可比性。所有患者切除組織標(biāo)本離體后盡快裝入EP管并立即轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。全部病理切片均由我院病理科兩位高年資病理醫(yī)師確診。

1.2HPV16/18 DNA檢測(cè)方法采用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)技術(shù)。分析試劑為亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司產(chǎn)品，操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。將兩組標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，提取的DNA作為模板DNA備用。模板DNA經(jīng)95 ℃加熱30 s變性，使模板DNA的雙鏈解離，形成單鏈。模板DNA經(jīng)加熱變性成為單鏈后，將溫度降至55～57 ℃，保持30 s，使單鏈模板DNA與引物的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。引物核苷酸序列設(shè)計(jì)如下：HPV16上游引物為5′-AAGGCCAACTAAATGTCAC-3′，下游引物為5′-CTGCTTTTATACTAACCGG-3′，片段長(zhǎng)度為267 bp；HPV18上游引物為5′-ACCTTAATGAAAAACCACGA-3′，下游引物為5′-CGTCGTTTAGAGTCGTTCCTG-3′，片段長(zhǎng)度為240 bp。將溫度升至72 ℃，DNA模板-引物結(jié)合物在聚合酶的作用下延伸1 min。共30個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)延伸延長(zhǎng)至7 min。將針對(duì)HPV16、18的序列特異性(SSO)核苷酸探針，分別固定在尼龍膜上，再與經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA靶序列雜交，探針為特異性的，不能交叉雜交；洗膜；顯色。結(jié)果判定：將探針與經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA靶序列進(jìn)行雜交，若探針在尼龍膜上顯藍(lán)色斑點(diǎn)，則可判斷為該HPV亞型陽(yáng)性，反之為陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

PCa組、BPH組HPV16/18 DNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.7%(22/60)、9.0%(5/55)，兩組比較，P<0.01。HPV16/18陽(yáng)性表達(dá)與PCa臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。

3　討論

PCa是歐美等西方國(guó)家最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)PCa的發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于歐美國(guó)家，但發(fā)病率、病死率近年來(lái)呈持續(xù)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，且增長(zhǎng)幅度較歐美發(fā)達(dá)國(guó)家更為迅速。HPV為雙鏈DNA病毒，具有嚴(yán)格的嗜上皮、嗜皮膚性。HPV16、18與泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病的關(guān)系十分密切[5]。有學(xué)者檢測(cè)陰莖癌組織中的HPV16/18 DNA，結(jié)果顯示HPV DNA的陽(yáng)性率為71.7%，提示HPV16/18的感染與陰莖癌的發(fā)生關(guān)系密切[6]。有研究[7]應(yīng)用免疫組化法測(cè)定膀胱癌標(biāo)本，結(jié)果顯示HPV16/18總陽(yáng)性率為65.4%，表明HPV16/18的感染是膀胱癌可能的致病因素之一。

表1　HPV16/18陽(yáng)性表達(dá)與PCa臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與臨床分期T1期+T2期相比，*P<0.05。

目前，關(guān)于HPV感染與PCa之間關(guān)系的研究很多[8,9]。有研究[10]運(yùn)用PCR方法觀察印度南方人群中HPV各基因型的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HPV16在PCa中的陽(yáng)性表達(dá)較高，可能與PCa有關(guān)。Dillner等[11]研究顯示，HPV18血清抗體陽(yáng)性提高了PCa進(jìn)展的危險(xiǎn)度。研究[12～14]顯示，HPV DNA在PCa組織中檢出率較高，高危型HPV陽(yáng)性率更高，致癌性HPV可能在前列腺腫瘤的病原學(xué)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。Leiros等[15]發(fā)現(xiàn)阿根廷PCa患者HPV的感染率達(dá)41.5%(17/41)。Anwar等[16]通過(guò)PCR法檢測(cè)68例日本PCa患者的HPV16、18及33亞型的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)24%。HPV在不同地區(qū)及國(guó)家PCa患者中的感染率不盡相同，其感染率主要與實(shí)驗(yàn)人群的年齡、性行為習(xí)慣及人群種族的易患性等因素相關(guān)。研究[14]發(fā)現(xiàn)，HPV16/18 DNA可使前列腺上皮細(xì)胞永生化，提示HPV感染可能在PCa的發(fā)生中扮演著重要角色。本研究結(jié)果提示，HPV16/18可能在PCa的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。本研究受實(shí)驗(yàn)條件所限，僅觀察了本地區(qū)少數(shù)PCa及BPH患者的HPV16/18感染情況，我國(guó)其他地區(qū)是否也存在這種趨勢(shì)，有待今后更多深入的調(diào)查以進(jìn)一步證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16/18在PCa臨床T分期中的表達(dá)有差異，提示HPV16/18感染與PCa的臨床T分期存在著一定的相關(guān)性，這意味著HPV16/18感染可能為臨床上評(píng)估PCa患者預(yù)后提供一定的幫助。但需注意的是，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅能表明HPV16/18在PCa高臨床T分期中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，不能證明HPV16/18的感染會(huì)導(dǎo)致PCa患者由低臨床T分期向高臨床T分期進(jìn)展，不排除高臨床T分期的PCa患者因免疫力下降等因素導(dǎo)致其對(duì)HPV病毒的易感性增加，從而加大了HPV感染的幾率。本研究結(jié)果顯示HPV16/18感染與PCa患者的年齡、PSA值、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)。未出現(xiàn)國(guó)外文獻(xiàn)[15]中所描述的HPV16/18的陽(yáng)性表達(dá)率隨PCa患者的年齡增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)。這可能是與飲食習(xí)慣、性行為開(kāi)放程度等與國(guó)外有差異有關(guān)，也可能是本實(shí)驗(yàn)樣本量的局限造成的。

PCa危險(xiǎn)因素包括年齡、家族遺傳性及種族，但確切致病機(jī)制及致病因素仍未明確。本研究發(fā)現(xiàn)PCa組織中HPV16/18陽(yáng)性率高，HPV16/18表達(dá)與腫瘤臨床分期有關(guān)。

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廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計(jì)劃項(xiàng)目(Z2014384)。

范永毅(E-mail： 1356138317@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.028

R737.25

B

1002-266X(2016)23-0083-03

2015-12-07)