任國(guó)平，王保蓮，王艷紅

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000)

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IL-17在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者外周血、蛻膜組織中的表達(dá)及意義

任國(guó)平，王保蓮，王艷紅

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000)

目的 觀察妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)患者外周血及蛻膜組織中IL-17的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 抽選50例ICP患者，其中輕度32例(輕度ICP組)、重度18例(重度ICP組)，選取同期50例健康孕婦作為對(duì)照組，采用免疫印跡法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)三組蛻膜組織中IL-17蛋白及IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用ELISA法測(cè)定外周血IL-17，采用酶循環(huán)法檢測(cè)外周血總膽汁酸(TBA)水平，并對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 重度ICP組外周血中IL-17、TBA水平及蛻膜組織中IL-17蛋白及IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于輕度ICP組，且均高于對(duì)照組，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。ICP患者蛻膜組織IL-17蛋白及IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量、外周血IL-17水平均分別與外周血TBA水平呈正相關(guān)(r分別為0.575、0.477、0.621，P均<0.05)，且ICP患者蛻膜組織中IL-17蛋白與IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.891，P<0.05)。結(jié)論 IL-17在ICP患者外周血、蛻膜組織中表達(dá)均升高，檢測(cè)外周血及蛻膜組織中IL-17表達(dá)有利于ICP的診斷及病情評(píng)估。

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；免疫調(diào)節(jié)；白細(xì)胞介素17；蛻膜；膽汁酸

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠中晚期并發(fā)癥，以皮膚瘙癢、黃疸、總膽汁酸(TBA)升高為臨床特征[1]。ICP主要危及胎兒，造成胎兒早產(chǎn)、宮內(nèi)窘迫、死亡等不良結(jié)局。其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)母胎間免疫功能障礙與ICP發(fā)病存在一定相關(guān)性[2]。有研究[3]表明，ICP患者外周血Th1型細(xì)胞因子表達(dá)明顯高于健康妊娠婦女，而Th2型下降，Th1/h2值呈升高趨勢(shì)；同時(shí)ICP患者胎盤(pán)組織中Th1型細(xì)胞因子濃度高于健康妊娠婦女。由此推測(cè)，無(wú)論是母體系統(tǒng)還是母胎界面，ICP患者均存在Th1/Th2平衡向Th1偏移的現(xiàn)象。Th17是一種不同于Th1和Th2細(xì)胞因子的新型CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，介導(dǎo)機(jī)體自身免疫及排斥反應(yīng)，可產(chǎn)生免疫激活因子。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于Th17細(xì)胞是否參與了ICP發(fā)病文獻(xiàn)報(bào)道較少。而有文獻(xiàn)[4]報(bào)道，前期、習(xí)慣性流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥中Th17細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。2010年3月～2015年5月，我們對(duì)比了健康及不同程度ICP孕婦外周血及蛻膜組織中Th17細(xì)胞分泌的IL-17細(xì)胞因子水平差異，旨在探討IL-17在ICP發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 50例ICP患者，其中輕度32例(輕度ICP組)，年齡(30.51±3.74)歲，孕周(37.85±0.47)周；重度18例(重度ICP組)，年齡(30.60±3.82)歲，孕周(37.91±0.51)周。ICP診斷及分度參照《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南》[5]，輕度ICP:①生化指標(biāo):血清TBA 10～39 μmol/L，直接膽紅素<6 μmol/L，甘膽酸10.73～43 μmol/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)<200 U/L，總膽紅素<21 nmol/L。②出現(xiàn)瘙癢癥狀，無(wú)明顯其他癥狀。重度ICP:①生化指標(biāo):血清TBA≥40 pmoI/L，甘膽酸≥43 μmol/L， 直接膽紅素≥6 μmol/L，AST、ALT≥200 U/L，總膽紅素≥21 nmol/L。②臨床瘙癢癥狀嚴(yán)重，伴其他臨床癥狀。均為單胎初產(chǎn)婦，妊娠期未采用激素等藥物治療，均實(shí)施剖宮產(chǎn)終止妊娠。選取同期50例查體健康孕婦作為對(duì)照組，年齡(30.73±3.51)歲，孕周(37.88±0.49)周，均實(shí)施剖宮產(chǎn)終止妊娠，原因?yàn)樘簩m內(nèi)窘迫、擠帶因素以及頭盆不稱(chēng)等，無(wú)其他妊娠并發(fā)癥。三組年齡、孕周比較具有可比性。研究對(duì)象及其家屬均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情同意，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清TBA、IL-17檢測(cè) 孕婦均于剖宮產(chǎn)術(shù)前抽取2份3 mL外周靜脈血,1份置入普通試管，采用日立7060全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清TBA水平進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法依據(jù)酶循環(huán)法。另1份血標(biāo)本置于促凝管中，靜置2 h后，常溫3 000 r/min離心10 min，分離出血清，立即置入-70 ℃冰箱保存待同批檢測(cè)血清IL-17水平。采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17水平，試劑盒由武漢華美生物公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 蛻膜組織IL-17 mRNA、蛋白表達(dá)檢測(cè) 術(shù)中患者胎盤(pán)娩出后，于胎盤(pán)附著中央子宮壁輕刮約2 cm×2 cm大小的蛻膜組織，鹽水沖洗后，置于-196 ℃液氮內(nèi)保存，待同批檢測(cè)IL-17 mRNA及IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量。①I(mǎi)L-17 mRNA表達(dá)檢測(cè)：a.RNA提取:釆用TRIzol法抽提RNA，研缽洗凈，0.1%DEPC浸泡過(guò)夜，密封后烘烤12 h。準(zhǔn)備各種規(guī)格Tip頭、EP管、PCR管等無(wú)菌無(wú)酶管。取凍存蛻膜組織放入液氮預(yù)冷研缽中，加入液氮研磨成粉，將TRIzol 1 000 μL加入其中，混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入三氯甲烷200 μL混勻離心后取上清液，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入異丙醇，混合離心，可見(jiàn)白色RNA沉淀。棄上清液，加入現(xiàn)配預(yù)冷的75%乙醇1 000 μL吹打離心。吸干管中乙醇，真空干燥，根據(jù)RNA沉淀量將滅菌的DEPC 10～20 μL注入其中。采用紫外/分光光度計(jì)對(duì)RNA水平和光密度值進(jìn)行檢測(cè)，采用RQ1 RNase-Free DNase試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)去除RNA樣品中g(shù)DNA雜質(zhì)。b.cDNA合成：將PCR管置于冰上，依次加入RQ1 RNase-Free DNase 10×Reaction Buffer 1 μL，RQl RNase-Free DNase 2 μL。加DEPC水補(bǔ)足至10 μL。輕柔混合，短暫離心后，逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃加熱15 min，85 ℃加熱5 s后停止反應(yīng)。c. RT-PCR反應(yīng)：引物及序列號(hào)β-actin F:5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，R：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；IL-17F:5′-TGTCCCCATCCAGCAAGAG-3′，R:5′-CCCACGGACACCAGTATCTTC-3′。以mRNA逆轉(zhuǎn)cDNA為反應(yīng)模板，設(shè)置無(wú)酶水代替cDNA為陰性對(duì)照組。PCR反應(yīng):95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 h，95 ℃加熱10 s生成溶解曲線(xiàn)。IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。②IL-17蛋白表達(dá)檢測(cè)：剪取蛻膜組織樣品，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說(shuō)明操作，采用免疫印跡法測(cè)定蛻膜組織IL-17蛋白濃度。使用分光光度計(jì)測(cè)定A562吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出IL-17蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；變量間相關(guān)性釆用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清TBA、IL-17水平比較 重度ICP組、輕度ICP組、對(duì)照組血清TBA水平分別為(54.28±1.69)、(20.58±1.68)、(2.97±1.63)μmol/L，三組兩兩比較，P均<0.05；重度ICP組、輕度ICP組、對(duì)照組血清IL-17水平分別為(23.33±2.04)、(15.48±2.16)、(10.96±2.14)pg/mL，三組兩兩比較，P均<0.05。

2.2 三組蛻膜組織中IL-17mRNA及蛋白表達(dá)比較 重度ICP組、輕度ICP組、對(duì)照組IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.71×104±0.71×104、3.77×104±0.74×104、2.03×104±0.73×104，三組兩兩比較，P均<0.05；IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.19±0.28、0.79±0.31、0.57±0.29，三組兩兩比較，P均<0.05。

2.3ICP患者蛻膜組織中IL-17蛋白及IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量與外周血IL-17、TBA相關(guān)性分析ICP患者蛻膜組織中IL-17蛋白及IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量、外周血IL-17水平均分別與外周血TBA水平呈正相關(guān)(r分別為0.575、0.477、0.621，P均<0.05)，且ICP患者蛻膜組織中IL-17蛋白與IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.891，P<0.05)。

3 討論

ICP作為一種非正常妊娠狀態(tài)，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，至今尚未得到確切闡明。ICP多發(fā)生于妊娠中晚期，臨床以皮膚瘙癢、血清TBA升高為特征，是妊娠期特有的一種并發(fā)癥，易造成胎兒不良結(jié)局。目前，醫(yī)學(xué)研究公認(rèn)為妊娠系自然同種半異體移植，妊娠是否成功取決于母胎間免疫耐受平衡，當(dāng)平衡被打破時(shí)，導(dǎo)致病理妊娠發(fā)生[6]。CD4+T細(xì)胞受到抗原刺激后，可分化為T(mén)h1、Th2、Th17及Treg四種不同亞型T細(xì)胞，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞亞群，其在細(xì)胞因子表達(dá)譜及免疫學(xué)功能上與一般細(xì)胞不盡相同，其中經(jīng)典Th1/Th2型失衡理論一直占據(jù)著ICP疾病免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的主導(dǎo)地位。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)展，CD4+T細(xì)胞(Th17)在自身免疫相關(guān)疾病中亦起重要作用。

Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，具有免疫激活的生物學(xué)作用[7]。細(xì)胞因子IL-17的異常升高與機(jī)體肝細(xì)胞自身免疫損傷有關(guān)，臨床表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積、TBA水平升高[8]。其中高血清TBA是ICP的主要生化特點(diǎn)，是其診斷、分度的主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。ICP孕婦體內(nèi)膽汁酸在肝內(nèi)排泄障礙，造成母體外周血TBA升高，進(jìn)而損害胎盤(pán)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使母血中的膽汁酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒，且胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)胎兒膽汁酸能力下降，這兩方面的共同作用最終引起胎兒膽汁淤積，進(jìn)而造成對(duì)胎兒的毒害作用，包括對(duì)胎兒腦、肺、胺帶血管等的毒性作用，是ICP早產(chǎn)率、圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因[9]。本實(shí)驗(yàn)中，重度ICP孕婦外周血中IL-17、TBA水平及蛻膜組織中IL-17蛋白濃度、IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于輕度ICP孕婦，且均高于正常孕婦，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示母胎界面蛻膜組織IL-17異常表達(dá)及外周血IL-17水平升高可能參與了ICP發(fā)病，且與其病情嚴(yán)重程度相關(guān)。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，ICP孕婦蛻膜組織IL-17蛋白濃度及IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量、外周血IL-17水平均分別與外周血TBA水平正相關(guān)，驗(yàn)證了前文推測(cè)的正確性。國(guó)內(nèi)外研究[10，11]證實(shí)，IL-17作為重要的炎性介質(zhì)，其生物學(xué)功能多樣。首先，其能剌激其他炎性細(xì)胞及趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶水平增高，導(dǎo)致炎性浸潤(rùn)及組織損傷；同時(shí)還可協(xié)同刺激對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞活化；其次，IL-17在機(jī)體免疫防御中發(fā)揮重要作用，如在胞外細(xì)菌或真菌侵襲時(shí)起介導(dǎo)保護(hù)性免疫作用，在自身免疫、過(guò)敏性疾病、腫瘤等炎癥反應(yīng)中亦發(fā)揮重要作用[12]。因此其高表達(dá)與肝臟免疫應(yīng)答密切相關(guān)，參與機(jī)體肝臟受損機(jī)制。ICP肝內(nèi)膽汁瘀積病理基礎(chǔ)為膽管、肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)發(fā)生改變，肝細(xì)胞對(duì)膽汁攝入、分泌功能異常[13，14]。我們推測(cè)，高表達(dá)的細(xì)胞因子IL-17可能通過(guò)激活肝臟免疫應(yīng)答，造成肝功能受損，從而引發(fā)ICP。

綜上所述，IL-17在ICP患者外周血、蛻膜組織中表達(dá)均升高，檢測(cè)外周血及蛻膜組織中IL-17表達(dá)有助于ICP的診斷及病情評(píng)估。

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