汪楓,喻小蘭,夏紀毅,3,王曉燕,唐利,曹勇,唐小平,夏國棟
(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,四川瀘州646000;2西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院;3西南醫(yī)科大學腫瘤研究所)
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·論著·
黃芩素、LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響
汪楓1,喻小蘭2,夏紀毅1,3,王曉燕1,唐利1,曹勇1,唐小平1,夏國棟1
(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,四川瀘州646000;2西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院;3西南醫(yī)科大學腫瘤研究所)
目的 探討黃芩素和PI3K特異性抑制劑LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞, 20 μmol/L DMSO及0、1、5、10、20 μmol/L黃芩素分別處理SMMC-7721細胞,顯微鏡觀察細胞數(shù)量變化; 20 μmol/L DMSO及0、1、2、5、10、20、50、100、200和300 μmol/L黃芩素和0、1、2、5、10、20、30 μmol/L的LY294002處理SMMC-7721細胞24 h,CCK8法檢測細胞增殖活性。將SMMC-7721細胞隨機分為4組,A組加入0 μmol/L黃芩素;B組加20 μmol/L DMSO;C組加20 μmol/L黃芩素;D組加20 μmol/L黃芩素和 10 μmol/L LY294002,培養(yǎng)24 h,流式細胞術檢測細胞周期并計算細胞凋亡比例、RT- PCR法和Western blotting法檢測凋亡相關因子Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達及p-AKT活性。 結果 SMMC-7721細胞數(shù)量隨黃芩素/LY294002濃度增加而顯著減少,細胞增殖活性明顯降低(P均<0.05)。與A、B組相比,C、D組的G0~G1期細胞比例明顯增多(P<0.05),S期細胞比例明顯下降,G2/M期細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05),C、D組G0~G1期細胞升高比例、S期細胞降低比例比較,P<均0.05。與A組和B組相比,C、D組早期凋亡和晚期凋亡細胞均明顯增多(P均<0.05),D組比C組早期凋亡和晚期凋亡細胞增多更明顯(P<0.05)。與A、B組相比,C、D組抑制凋亡因子Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05),凋亡促進因子Bax mRNA水平顯著增高(P<0.05);D組Bcl-2 mRNA水平比C組降低更明顯,而Bax mRNA水平比C組升高更明顯(P均<0.05)。與A、B組相比,C、D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平顯著降低(P均<0.05),凋亡促進因子Bax表達量顯著增高(P均<0.05),D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平降低比C組更明顯(P均<0.05),凋亡促進因子Bax表達量升高比C組更明顯(P均<0.05)。結論 黃芩素與LY294002可能通過調(diào)控凋亡相關因子的表達及增加活化的AKT水平從而誘導SMMC-7721細胞凋亡,抑制其增殖,且二者有協(xié)同效應。
肝癌;黃芩素;磷酸肌醇3激酶抑制劑;人肝癌細胞系SMMC-7721細胞;細胞凋亡
原發(fā)性肝細胞癌(HCC)臨床常用的治療方法有手術、放療和化療[1]。但肝癌易轉移及復發(fā),對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性,臨床療效和預后不理想,因此,尋找新的藥物和分子治療靶點是治療肝癌的關鍵[2]。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT信號通路是參與多種癌細胞惡性增殖、分化、凋亡、心血管形成和侵襲轉移的重要信號通路,多種藥物誘導肝癌細胞凋亡均通過干擾PI3K/AKT信號通路[3]。生長因子受體如PDGF、IGF、EGF和胰島素等受體活化后可激活PI3K,使細胞質(zhì)膜上的3-磷酸肌醇磷脂含量增加,AKT與3-磷酸肌醇磷脂結合后被部分活化,PKB激酶被3-磷酸肌醇磷脂激活后使AKT磷酸化并全部激活,AKT被激活后,可激活核糖體S6激酶,促進Bcl-2表達,抑制細胞凋亡。Bax和Bcl-2是調(diào)控細胞凋亡的重要成員,Bcl-2/Bax值大小決定細胞是否凋亡,比值小,細胞凋亡,反之,細胞存活[4]。LY294002是PI3K的特異性抑制劑,能完全抑制PI3K的p110亞單位催化活性。黃芩素和LY294002均有抑制多種腫瘤的作用,但二者在肝癌中的療效罕見報道。2015年2月~2016年3月,我們探討了黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響。
1.1 材料 人肝癌細胞系SMMC-7721用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。黃芩素購于Sigma公司,純度為99%,充分溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,儲存液濃度為5 000 μg/L(DMSO終濃度≤0.2%),4 ℃避光保存,實驗時用細胞培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。LY294002購于Alexis公司,TRIzol試劑購于Invitrogen公司,細胞周期試劑盒購于南京凱基生物發(fā)展有限公司,逆轉錄試劑盒購于Fermentas公司。小鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人AKT抗體及兔抗人p-AKT抗體均購于CST公司,辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)及辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(H+L)購于碧云天公司,引物均由上海生工合成。CCK8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購于拓然生物科技公司。
1.2 細胞數(shù)量變化觀察 人肝癌細胞系SMMC-7721用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),根據(jù)具體情況更換培養(yǎng)基和傳代,取對數(shù)生長期細胞進行實驗,分別加入DMSO 20 μmol/L及0、1、5、10、20 μmol/L黃芩素進行處理,24 h后,低倍境下觀察細胞數(shù)量變化。
1.3 細胞增殖活性檢測 采用CCK8法。調(diào)整細胞濃度至每孔200 μL 共1×103個細胞接種于96孔板,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞貼壁后,加入不同濃度黃芩素(DMSO對照、0、1、2、5、10、20、50、100、200和300 μmol/L)或LY294002(DMSO對照、0、1、2、5、10、20、30 μmol/L),培養(yǎng)24 h,每個樣本重復3次,加入CCK8溶液10 μL,混勻;培養(yǎng)4 h,生成Formazan測定450 nm波長處的吸光度值(A值),A值與細胞增殖活性呈正比。
1.4 細胞周期及凋亡檢測 采用流式細胞術。調(diào)整細胞濃度,接種于12孔板,每孔細胞數(shù)5×105個,無血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基,將細胞隨機分為四組,A組為空白對照組(Control組),不予干預;B組加入DMSO 20 μmol/L;C組加入黃芩素20 μmol/L;D組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L,培養(yǎng)24 h,收集細胞,室溫PBS洗滌2次,加入70%預冷乙醇1 mL固定過夜,第2天離心去除乙醇,PBS重懸,加入RNaseA至終質(zhì)量濃度為100 mg/L,37 ℃水浴30 min,加入終質(zhì)量濃度為50 mg/L的PI染色液,4 ℃避光染色30 min,用激發(fā)波長為488 nm的紅色熒光檢測細胞周期。結果采用細胞周期擬合軟件進行分析,記錄亞二倍體峰,即凋亡細胞峰sub-G1期、G0~G1期、S期、G2~M期細胞比例,實驗重復3次。細胞凋亡檢測按照相關的試劑盒說明進行操作,檢測結果采用CellQuest軟件進行分析,實驗重復3次。
1.5 凋亡相關基因mRNA表達檢測 采用Real Time PCR法。調(diào)整細胞濃度,接種于6孔板,每孔細胞數(shù)1×106個,無血清PRMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基,細胞隨機分為五組,A組為空白對照組(Control組),不予干預;B組加入DMSO 20 μmol/L;C組加入黃芩素20 μmol/L;D組加入LY294002 10 μmol/L,E組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L,培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)基,PBS洗2遍,用TRIzol提取總RNA,采用Thermo Fermentas公司生產(chǎn)的反轉錄試劑盒K1622反轉錄成cDNA第一鏈,采用Real Time PCR檢測凋亡相關基因表達,實驗重復3次。引物序列如下:Bax上游引物:5′-CATATAACCCCGTCAACGCAG-3′,下游引物:5′-GCAGCCGCCACAAACATAC-3′;Bcl-2上游引物:5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′,下游引物:5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′;GAPDH上游引物:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。
1.6 凋亡相關基因蛋白表達檢測 采用Western blotting法。調(diào)整細胞濃度,接種于6孔板,每孔細胞數(shù)1×106,無血清PRMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基,細胞隨機分為五組,A組為空白對照組(Control組),不予干預;B組加入DMSO20 μmol/L;C組加入黃芩素20 μmol/L;D組加入LY294002 10 μmol/L,E組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L,培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)基,PBS洗2次,加入臨時配用、終濃度為5%蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑的裂解液,冰浴20 min,使細胞全部裂解,12 000 r/min離心后取上清液,收集細胞總蛋白。采用BCA測定蛋白濃度并統(tǒng)一各組濃度為1.2 μg/μL后,取25 μL體積蛋白樣本進行10%SDS-PAGE電泳,用電轉儀將蛋白質(zhì)轉入PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗(Bax稀釋比例為1∶800,Bcl-2稀釋比例為1∶500, AKT稀釋比例為1∶1 000,P-AKT稀釋比例為1∶500,GAPDH稀釋比例為1∶2 000)4 ℃孵育過夜。1×TBST漂洗2次,5 min/次,辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(H+L)及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)(二抗稀釋比例均為1∶2 000)室溫孵育1 h,1×TBST漂洗3次,10 min/次,凝膠成像儀成像后通過Quantity One軟件進行灰度分析,計算相關蛋白表達。實驗重復3次。
1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件。計量數(shù)據(jù)以表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 黃芩素干預后SMMC-7721細胞數(shù)量變化 與黃芩素0μmol/L和DMSO20μmol/L相比,不同濃度黃芩素處理SMMC-7721 24h,細胞凋亡隨黃芩素濃度升高越來越顯著(P均<0.01)。黃芩素可誘導SMMC-7721細胞凋亡且呈濃度依賴性(P均<0.05),詳見表1。
表1 不同濃度藥物干預后細胞數(shù)量比較(個,
2.2 黃芩素或LY294002對SMMC-7721細胞增殖的影響 黃芩素或LY294002可顯著抑制SMMC-7721細胞增殖且呈濃度依賴性(P均<0.05),詳見表2、表3。
2.3 黃芩素或LY294002對SMMC-7721細胞周期的影響 與A組和B組相比,C組G0~G1期細胞比例明顯增多(P均<0.05),S期細胞比例明顯下降,G2~M期細胞比例變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),D組G0~G1期細胞比例升高更顯著(P<0.05),S期細胞比例降低更明顯(P<0.05),G2~M期細胞無明顯變化(P>0.05)。黃芩素和LY294002聯(lián)用可明顯增加SMMC-7721細胞G1期細胞比例,降低S期細胞比例(表4)。
表2 不同濃度黃芩素干預后人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖活性比較
表3 不同濃度LY294002干預后人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖活性比較
表4 黃芩素或LY294002干預后各組SMMC-7721細胞周期所占比例比較
2.4 黃芩素或LY294002誘導對SMMC-7721細胞凋亡的影響 與A組和B組相比,C組早期凋亡和晚期凋亡細胞比例均明顯增多(P均<0.05),D組早期凋亡和晚期凋亡細胞比例增多更明顯(P<0.05)。黃芩素和LY294002均可誘導SMMC-7721細胞早期凋亡和晚期凋亡,且二者有協(xié)同效應(表5)。
2.5 黃芩素或LY294002干預后各組SMMC-7721細胞凋亡相關因子mRNA表達比較 與A組或B組相比,C組的抑制凋亡因子Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05),凋亡促進因子Bax mRNA水平顯著增高(P<0.05);D組Bcl-2 mRNA水平降低更明顯,而Bax mRNA水平升高更明顯。黃芩素聯(lián)合LY294002誘導人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡效果更顯著(表6)。
表5 黃芩素或LY294002誘導SMMC-7721早期及晚期凋亡細胞所占比例比較
表6 黃芩素或LY294002干預后各組SMMC-7721細胞凋亡相關因子mRNA表達比較
2.6 黃芩素或LY294002干預后各組SMMC-7721細胞凋亡相關蛋白表達比較 與A組和B組相比,C組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平顯著降低,凋亡促進因子Bax表達量顯著增高,D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平降低更明顯,凋亡促進因子Bax表達量升高更明顯(P均<0.05)。黃芩素聯(lián)合LY294002誘導人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡更明顯(表7)。
表7 黃芩素或LY294002干預后各組SMMC-7721細胞凋亡相關蛋白表達比較
肝癌是發(fā)展中國家發(fā)病率位居第五和致死率位居第二的腫瘤[5]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是復雜的過程,探究肝癌增殖、凋亡的分子機制,尋找治療肝癌的新藥物有重要臨床意義。
黃芩素是從中藥黃芩根部提取的黃酮類化合物,具有廣泛的抗病毒、抗炎作用,我們前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖[6]、促進宮頸癌HeLa細胞凋亡[7],但其在肝癌中的療效還未得到完全闡述。LY294002是PI3K的特異性抑制劑,能完全抑制PI3K的p110亞單位催化活性,可抑制癌細胞增殖,促進癌細胞凋亡[8]。本研究表明聯(lián)合使用黃芩素和LY294002刺激人肝癌細胞系SMMC-7721,可使肝癌細胞數(shù)量明顯減少。
PI3K/AKT信號通路廣泛存在于真核細胞中,在細胞代謝、增殖和凋亡等過程中起關鍵作用[3, 9]。生長因子受體活化后可激活PI3K,使細胞質(zhì)膜3-磷酸肌醇磷脂含量增高[10]。AKT可與質(zhì)膜上的3-磷酸肌醇磷脂(主要是PI-3,4和5-P3)結合并被部分活化[11]?;罨腁KT可激活核糖體S6激酶,促進蛋白質(zhì)合成和細胞增殖,AKT亦可促進Bcl-2表達,抑制細胞凋亡[12]。Bcl-2家族是目前最受重視與細胞凋亡密切相關的一類基因,包括凋亡抑制基因Bcl-2類和凋亡促進基因Bax類[13, 14]。Bcl-2類包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等,Bax類包括Bax、Bak、Box等。一般來說,Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡,當Bax與Bcl-2形成異源二聚體時,則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能,Bcl-2/Bax值決定了細胞接受凋亡信號后存活與否,Bax占優(yōu)勢時細胞死亡,Bcl-2占優(yōu)勢時細胞存活[13,15]。癌癥細胞的凋亡與治療效果密切相關。我們的研究表明黃芩素或LY294002通過降低Bcl-2/Bax值和AKT磷酸化水平,從而降低細胞增殖,使絕大多數(shù)細胞阻滯于G0~G1期,誘導肝癌細胞的凋亡。
本研究結果顯示,黃芩素/LY294002干預后,可明顯減少肝癌細胞數(shù)量并呈濃度依賴性,提示黃芩素/LY294002可抑制肝癌細胞增殖。黃芩素與LY294002聯(lián)用較兩者單獨使用時,肝癌細胞數(shù)量減少更顯著,細胞增殖受抑程度與凋亡增加程度更明顯。同時黃芩素與LY294002聯(lián)用較兩者單獨使用時,Bcl-2表達水平明顯降低,而Bax表達水平明顯升高,p-AKT水平明顯降低。以上結果提示在肝癌細胞中黃芩素與LY294002通過降低p-AKT進而降低Bcl-2表達水平,增加Bax表達水平抑制肝癌細胞增殖并誘導凋亡。
綜上所述,黃芩素和LY294002作為新型的抗腫瘤-中草藥和小分子抑制劑,通過降低凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達比例,顯著抑制SMMC-7721細胞增殖,誘導細胞凋亡,且二者有協(xié)同抗腫瘤效應。
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Effects of baicalein and LY294002 on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line SMMC-7721
WANGFeng1,YUXiaolan,XIAJiyi,WANGXiaoyan,TANGLi,CAOYong,TANGXiaoping,XIAGuodong
(1TheAffiliatedHospitalofSouthWestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)
Objective To investigate the effects of baicalein and phosphoinositide 3 kinase inhibitor LY294002 on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line SMMC-7721. Methods SMMC-7721 cells were cultured in vitro, and the cell proliferation of SMMC-7721 cells was measured by CCK8 when SMMC-7721 cells were treated with 20 μmol/L DMSO and 0, 1, 5, 10, 20 μmol/L baicalein.The cell proliferative activity of SMMC-7721 cells was measured by CCK8 when SMMC-7721 cells were treated with 20 μmol/L DMSO, 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 and 300 μmol/L baicalein and 0, 1, 2, 5, 10, 20 and 30 μmol/L LY294002. Then SMMC-7721 cells were randomly divided into 4 groups: group A which was added with 0 μmol/L baicalein, group B with 20 μmol/L DMSO, group C with 20 μmol/L baicalein and group D with 20 μmol/L baicalein and 10 μmol/L LY294002 for 24 hours. The cell cycle and apoptosis of SMMC-7721 cells were detected by flow cytometry, the mRNA and protein levels of apoptosis-related factors Bcl-2, Bax as well as pAKT activity was detected by RT-PCR and Western blotting. Results SMMC-7721 cells were dramatically decreased with the increasing concentrations of baicalein and LY294002, with a dose-dependent manner, CCK8 assay indicated that both baicalein and LY294002 dramatically inhibited the proliferation of SMMC-7721 (allP<0.05). Compared with groups A and B, the proportion of cells in G0-G1phase of groups C and D was significantly higher (P<0.05). The proportion of cells in S phase was decreased and the cell changes in G2/M phase was not statistically different (P>0.05). In the groups C and D, the proportion of cells in G0-G1phase increased, and the proportion of cells in S phase decreased (allP<0.05). Compared with groups A and B, the early and late apoptotic cells in the groups C and D were significantly increased (allP<0.05), and the early and late apoptotic cells in the group D were more than those in the group C (P<0.05). Compared with groups A and B, the expression of Bcl 2 mRNA in the groups C and D was significantly decreased (P<0.05), and the level of Bax mRNA was significantly increased (P<0.05). The level of Bcl-2 mRNA in the group D was significantly lower than that in the group C, while the level of Bax mRNA was significantly higher than that in the group C (allP<0.05). Compared with groups A and B, the expression of Bcl-2 and the phosphorylation of AKT in the groups C and D was significantly decreased (allP<0.05) and the expression of Bax was significantly increased (allP<0.05). The expression of Bcl-2 and the phosphorylation of AKT in group D was significantly higher than that in the group C (allP<0.05) and the expression of Bax was significantly higher than that in the group C (allP<0.05).Conclusion Baicalein or LY294002 could induce apoptosis and inhibit the proliferation of SMMC7721 cells by regulating the expression of apoptosis-related factors and increasing the level of activated AKT, and the synergistic effect was found between them.
liver carcinama; baicalein; phosphoinositide 3 kinase inhibitor LY294002 cells; human liver cancer cell line SMMC-7721 cells; apoptosis
四川省科技廳項目(14JC01383-LH53)。
汪楓(1978-),男,主治醫(yī)師,學士,主要研究方向為肝癌的機制研究。E-mail:wangfeng21080@163.com
簡介:夏國棟(1975-),男,副主任醫(yī)師,碩士,主要研究方向為肝癌的機制研究。E-mail:xjyi0615@163.com
10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.001
R735.7
A
1002-266X(2016)41-0001-05
2016-04-10)