楊敏，徐桂華

(南京中醫(yī)藥大學護理學院，南京210000)

·綜述·

蛋白質(zhì)組學在腰椎間盤突出癥中的研究進展

楊敏，徐桂華

(南京中醫(yī)藥大學護理學院，南京210000)

腰椎間盤突出癥(LDH)是骨科常見病與多發(fā)病，其機制的初步探明已為LDH的診斷與治療提供了重要信息，但更深層次的分子機制尚不明了。蛋白質(zhì)組學注重參與特定生理或病理狀態(tài)下的所有蛋白質(zhì)，為篩選疾病特異性生物標記物，探索發(fā)病機制與治療靶點提供了新途徑。蛋白質(zhì)組學的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學技術(shù)以及相對和絕對定量同位素標記技術(shù)等，其在研究LDH中醫(yī)證型診斷，神經(jīng)根損傷、坐骨神經(jīng)痛以及腰椎退行性變發(fā)病機制中的應用已經(jīng)比較明確，且取得了一定進展。

腰椎間盤突出癥；蛋白質(zhì)組學；蛋白質(zhì)分離技術(shù)；神經(jīng)根損傷；腰椎退行性變

腰椎間盤突出癥(LDH)是指腰椎間盤各部分發(fā)生退行性變后，在外力因素的作用下，纖維環(huán)部分或全部破裂，單獨或連同髓核、軟骨終板向外突出，導致竇椎神經(jīng)和神經(jīng)根遭受刺激或壓迫，從而引起以腰腿痛為主要癥狀的一種疾病。LDH為骨科常見病和多發(fā)病，占門診腰痛患者的10%～15%，占骨科腰腿痛住院患者的25%～40%[1]。近年來LDH的發(fā)病率呈升高趨勢[2]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)的研究對象是生命活動的最終執(zhí)行者——蛋白質(zhì)，該技術(shù)可篩選出與疾病相關(guān)的特異性生物標記物，有助于探索發(fā)病機制與治療靶點，為LDH的深入研究提供新思路。

1 蛋白質(zhì)組學的常用技術(shù)

蛋白質(zhì)組的概念由澳大利亞學者Wilkins和Williams于1994年提出，是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)[3]。由其引申出的蛋白質(zhì)組學則是從整體角度出發(fā)，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用和聯(lián)系，使人們能夠在分子水平上定量、動態(tài)、整體探討生命活動的規(guī)律和生命現(xiàn)象的本質(zhì)[4]。目前，蛋白質(zhì)組學的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學技術(shù)及相對和絕對定量同位素標記技術(shù)。

1.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 該技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳(2-DE)、雙向熒光差異電泳以及液相色譜(LC)技術(shù)等，其中2-DE為最經(jīng)典、最成熟的蛋白質(zhì)組學分離技術(shù)，它依據(jù)蛋白質(zhì)等電點與相對分子質(zhì)量的不同而實現(xiàn)蛋白高通量的分離。2-DE技術(shù)在第一向IPG 膠條的制備和第二向凝膠的處理方面都有了很大提高，已廣泛應用于醫(yī)學研究。Qian等[5]運用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與膽固醇結(jié)石形成有關(guān)的4種蛋白質(zhì)；Ayyub等[6]憑借該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了可能對肺癌早期診斷有價值的蛋白生物標記物。

1.2 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 目前最普遍的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)為生物質(zhì)譜分析技術(shù)，質(zhì)譜可先將分析物離子化，隨后質(zhì)荷比不同的帶電粒子在空間或時間上分離并排列成圖譜，根據(jù)所形成的圖譜對分析物進行檢測鑒定[7]。常用的一級質(zhì)譜技術(shù)有基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、電噴射離子井飛行時間質(zhì)譜以及表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)等。除此以外，二級質(zhì)譜即同時將兩個一級質(zhì)譜連在一起構(gòu)成的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)，因具有較高的特異性與靈敏性，且所需樣本量少，逐漸受到研究者的青睞。如串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為新生兒遺傳代謝疾病的初篩手段，大大提高了疾病檢出率，有助于疾病的早期診斷和治療，從而降低病死率，改善預后[8]。

1.3 生物信息學技術(shù) 經(jīng)過分離與鑒定，還需對蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)進行分析。蛋白質(zhì)的功能分析一般采用Mascot搜索Swiss-prot、PIR等常用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，將樣品蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)序列進行比較以了解其功能；也可通過蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)進行預測，或者與保守基序和圖形數(shù)據(jù)庫比較，以判斷其功能。相比蛋白質(zhì)功能的測定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定則困難許多。雖然在PDB等數(shù)據(jù)庫中可檢測到蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的同源性，但蛋白質(zhì)的折疊過程仍不清晰。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預測是目前最困難、最復雜的預測技術(shù)，目前采用的方法有同源模建、threadin算法等[9]。

1.4 相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)技術(shù) iTRAQ技術(shù)是美國應用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項新的體外同位素標記技術(shù)，具有高通量、高靈敏的特點，它的出現(xiàn)促使比較蛋白質(zhì)組學向定量蛋白質(zhì)組學升級發(fā)展[10]。iTRAQ技術(shù)的流程如下：將樣品酶分解為肽段后，分別用iTRAQ試劑進行差異標記、混合，最后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)進行分析。該技術(shù)可對同一實驗下的8個樣品同時進行相對量化，大大降低實驗過程中的技術(shù)誤差，因此很多醫(yī)學研究者用此技術(shù)尋找疾病狀態(tài)下的特異表達蛋白，以發(fā)現(xiàn)治療藥物的新靶點。Ran等[11]通過對15例胃癌患者的胃組織進行iTRAQ技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)包括嗅質(zhì)蛋白4在內(nèi)的4種蛋白質(zhì)表達上調(diào)，且體外研究發(fā)現(xiàn)抑制嗅質(zhì)蛋白4的表達后，胃癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲與增殖也受到抑制。因此，抑制嗅質(zhì)蛋白4的表達可能成為未來抗癌藥物研制的方向之一。

2 蛋白質(zhì)組學在LDH中的應用

2.1 在LDH中醫(yī)證型診斷中的應用 蛋白質(zhì)組學是研究生物信息學在整體水平上的相互作用，與中醫(yī)的整體觀念不謀而合，并且其客觀的研究結(jié)果可彌補傳統(tǒng)中醫(yī)辨證指標主觀性強的缺點[12]。蛋白質(zhì)組學運用于LDH的中醫(yī)證型診斷為研究其辨證規(guī)律提供了新思路。許建文等[13]應用SELDI-TOF-MS技術(shù)對LDH血瘀證患者、LDH非血瘀證患者和健康人血清蛋白質(zhì)組學進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)了11個差異蛋白質(zhì)點；其采用Biomarker Patterns軟件構(gòu)建LDH血瘀證的血清學診斷模型，結(jié)果顯示LDH血瘀證患者ROC曲線下面積為0.984，說明該血清學診斷模型的診斷價值較高。趙偉等[14]采用SELDI-TOF-MS技術(shù)及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測壯族LDH血瘀證患者、漢族LDH血瘀證患者、壯族LDH非血瘀證患者和漢族LDH非血瘀證患者的血清樣本，共找出13個表達顯著差異的蛋白質(zhì)點，并由此構(gòu)建出壯族LDH血瘀證的血清學診斷模型；經(jīng)盲法驗證，該模型陽性預測值達到94.44%，表明由13個差異表達蛋白構(gòu)成的診斷模型可區(qū)分壯族與其他民族LDH血瘀證及其他中醫(yī)證型。以上研究為應用生物標志物進行LDH的中醫(yī)辨證奠定基礎(chǔ)。

2.2 在神經(jīng)根損傷發(fā)病機制研究中的應用 神經(jīng)根受壓是LDH的主要病理特征之一，除了單純的機械作用，突出的髓核可能引起神經(jīng)根的生化與免疫反應，從而引起LDH的一系列臨床癥狀。Liu等[15]采集觀察組(LDH引起的脊神經(jīng)根損傷患者)與對照組(椎間盤正?；颊?的腦脊液，使用2-DE結(jié)合LC-IT-MS技術(shù)分析腦脊液蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間存在15個表達差異的蛋白質(zhì)點，其中9個在觀察組腦脊液中水平升高，包括胱抑蛋白C、載脂蛋白A-IV、維生素D結(jié)合蛋白、神經(jīng)微絲的3種L蛋白、四連接素、免疫球蛋白G和血紅蛋白，并通過ELISA法證實了這些蛋白質(zhì)表達的改變可能與LDH引起的脊神經(jīng)根損傷有關(guān)。有研究建立了大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓(CCD)模型，28天后處死大鼠，提取蛋白，先通過雙向電泳分離蛋白，找出差異表達蛋白質(zhì)點后運用MALDI-TOF-MS技術(shù)進行鑒定，分析所得肽指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)共15種差異表達的蛋白；其中7種蛋白在CCD組表達上調(diào)(其中1種蛋白只存在于CCD組)，并推測膜聯(lián)蛋白A2、p11和蛋白激酶Ce蛋白表達的上調(diào)可能參與了神經(jīng)性疼痛的發(fā)生[16, 17]。

2.3 在坐骨神經(jīng)痛發(fā)病機制研究中的應用 LDH是導致坐骨神經(jīng)痛的主要原因之一，但其機制尚未明確；椎間盤源性痛目前主要依賴經(jīng)驗推測，無法通過臨床診斷證實[18]，而蛋白質(zhì)組學有可能成為該病最有效的生物標記物追蹤技術(shù)。Xie等[19]借助2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，分析了30例由LDH引起坐骨神經(jīng)痛患者與30位健康志愿者的血清樣本，發(fā)現(xiàn)了6種差異蛋白質(zhì)，包括表達升高的載脂蛋白-L1與兩種血清白蛋白前體，以及表達降低的載脂蛋白M、四連接素與免疫球蛋白輕鏈；并通過ELISA法進行反向驗證，結(jié)果表明載脂蛋白-L1、載脂蛋白M、四連接素以及免疫球蛋白輕鏈這4種蛋白質(zhì)可能是與LDH引起的坐骨神經(jīng)痛相關(guān)的生物標志物。

2.4 在腰椎退行性變研究中的應用 腰椎退行性變是LDH發(fā)生的致病基礎(chǔ)，因此腰椎退行性變后的蛋白質(zhì)組學研究也成為LDH蛋白質(zhì)組學研究的重要方向[20]。馮皓宇等[21]采用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS對人正常椎間盤纖維環(huán)和髓核細胞外基質(zhì)分子蛋白進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了19種相同的蛋白質(zhì)，為進一步研究這些蛋白質(zhì)在椎間盤退變過程中的變化打下基礎(chǔ)。呂志德等[22]通過2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)確定了正常和退變腰椎間盤組織中的6種差異蛋白質(zhì)，有助于深入研究這些蛋白質(zhì)在腰椎退行性變過程中的作用及其機制。Ye等[23]通過對椎間盤退行性變患者與正常患者的纖維環(huán)細胞蛋白質(zhì)表達進行分析，找到了10種差異表達的蛋白質(zhì)，認為這些蛋白質(zhì)與椎間盤退行性變的發(fā)病有關(guān)，并可作為其生物標志物。Yee等[24]采用iTRAQ標記LC-MS/MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)退變椎間盤組織中Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白與HTRA1等蛋白表達上調(diào)，這種變化在年輕椎間盤退化患者的纖維環(huán)組織中亦能觀察到，證實椎間盤細胞外基質(zhì)的改變與其衰老和退化有關(guān)。以上研究可為腰椎退行性變生物特異性標記物的確定及靶向藥物的研發(fā)提供參考。

綜上所述，與傳統(tǒng)技術(shù)注重研究單一蛋白質(zhì)不同，蛋白質(zhì)組學注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)下的所有蛋白質(zhì)，這樣的優(yōu)勢使其在多個醫(yī)學領(lǐng)域被廣泛研究與應用。LDH的早期防治與發(fā)病機制的闡明是目前醫(yī)學的難點和重點，但蛋白質(zhì)組學的興起為該問題的解決帶來了新的希望。盡管與骨科其他經(jīng)典的檢驗技術(shù)相比，蛋白質(zhì)組學技術(shù)尚不成熟，如2-DE技術(shù)檢測敏感性與分辨率較低，質(zhì)譜技術(shù)對低分子量蛋白質(zhì)的鑒定效果欠佳等。但是，隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷完善和更多新技術(shù)的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)組學技術(shù)會為闡明LDH的發(fā)病機制、識別早期病變、明確診斷等做出更大的貢獻。目前，運用蛋白質(zhì)組學闡明LDH發(fā)病機制的研究正在開展，但是尚缺乏運用該技術(shù)探討蛋白質(zhì)變化與治療效果之間關(guān)系的研究，今后可從蛋白質(zhì)組層面闡述LDH的治療手段。

[1] 楊濱,馬華松,鄒德威.腰椎間盤突出癥概述[J].中國臨床醫(yī)生,2011,39(1):18-21.

[2] Zhang YG, Sun Z, Zhang Z, et al. Risk factors for lumbar intervertebral disc herniation in Chinese population: a case-control study[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2009,34(25):E918-E922.

[3] Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, et al. Progress with gene-product mapping of the mollicutes: mycoplasma genitalium[J]. Electrophoresis, 1995,16(7):1090-1094.

[4] 申定珠,李家邦,蔣榮鑫,等.證候蛋白質(zhì)組學與中醫(yī)證候?qū)W相關(guān)性探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,26(4):366-368.

[5] Qian C, Shen Z, Zhang J, et al. Identification of cholesterol gallstone with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J]. Ann Hepatol, 2015,14(2):251-258.

[6] Ayyub A, Saleem M, Musharraf SG, et al. Mass spectrometric identification, characterization and validation of the haptoglobin beta-chain protein as a lung cancer serum biomarker[J]. Mol Med Rep, 2015,12(3):3755-3762.

[7] Shi R, Kumar C, Zougman A, et al. Analysis of the mouse liver proteome using advanced mass spectrometry[J]. J Proteome Res, 2007,6(8):2963-2972.

[8] Yoon HR. Screening newborns for metabolic disorders based on targeted metabolomics using tandem mass spectrometry[J]. Ann Pediatr Endocrinol Metab, 2015,20(3):119-124.

[9] 王英超,黨源,李曉艷,等.蛋白質(zhì)組學及其技術(shù)發(fā)展[J].生物技術(shù)通訊,2010,21(01):139-144.

[10] Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J]. Mol Cell Proteomics, 2004,3(12): 1154-1169.

[11] Ran X, Xu X, Yang Y, et al. A quantitative proteomics study on olfactomedin 4 in the development of gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2015,47(5):1932-1944.

[12] 陳文宇,呂曉東,姚明,等.蛋白質(zhì)組學技術(shù)應用于中醫(yī)證候研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊,2014,32(3):573-575.

[13] 許建文,韋貴康,鐘遠鳴,等.構(gòu)建腰椎間盤突出癥血瘀證的血清蛋白指紋圖譜模型[J].中國組織工程研究,2014,18(5):724-729.

[14] 趙偉,韋玉蘭,尹利軍,等.壯族腰椎間盤突出癥血瘀證血清標志物的質(zhì)譜鑒定及其血清診斷模型的構(gòu)建(英文)[J].中國矯形外科雜志,2015,23(1):64-69.

[15] Liu X, Zeng B, Xu J, et al. Proteomic analysis of the cerebrospinal fluid of patients with lumbar disk herniation[J]. Proteomics, 2006,6(3):1019-1028.

[16] Zhang Y, Wang YH, Zhang XH, et al. Proteomic analysis of differential proteins related to the neuropathic pain and neuroprotection in the dorsal root ganglion following its chronic compression in rats[J]. Exp Brain Res, 2008,189(2):199-209.

[17] 張楊,張燕,王永慧,等.大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后差異蛋白質(zhì)表達分析[J].中國康復醫(yī)學雜志,2010,25(10):928-936.

[18] Bogduk N. What′s in a name? The labelling of back pain[J]. Med J Aust, 2000,173(8):400-401.

[19] Xie P, Liu B, Chen R, et al. Comparative analysis of serum proteomes: identification of proteins associated with sciatica due to lumbar intervertebral disc herniation[J]. Biomed Rep, 2014,2(5):693-698.

[20] 袁良忠.腰椎間盤突出組織中IL-1、MMP-3的水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2011,51(30):64-65.

[21] 馮皓宇,郝躍峰,關(guān)海山,等.人椎間盤軟骨細胞外基質(zhì)小分子蛋白的雙向電泳和質(zhì)譜鑒定[J].蘇州大學學報(醫(yī)學版),2006,26(1):17-20.

[22] 呂志德,周初松,靳安民,等.正常和退變腰椎間盤蛋白質(zhì)的雙向電泳和質(zhì)譜鑒定[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(7):1271-1274.

[23] Ye D, Liang W, Dai L, et al. Comparative and quantitative proteomic analysis of normal and degenerated human annulus fibrosus cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2015,42(5):530-536.

[24] Yee A, Lam MP, Tam V, et al. Fibrotic-like changes in degenerate human intervertebral discs revealed by quantitative proteomic analysis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2015,24(3):503-513.

國家自然科學基金資助項目(81473791)；江蘇省基礎(chǔ)研究計劃自然科學基金資助項目(BK20141464)；江蘇省第四期“333工程”培養(yǎng)基金資助項目。

徐桂華(E-mail: xgh88@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.037

R681.5

A

1002-266X(2016)16-0095-03

2015-11-26)