趙魯明，楊玉城，魏立梅，丁剛

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東青州 262500)

?

人牙周膜干細(xì)胞膜片的制備

趙魯明，楊玉城，魏立梅，丁剛

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東青州 262500)

目的 制備人牙周膜干細(xì)胞(hPDLSC)膜片。方法 刮取接受正畸治療的20例患者完整拔除的前磨牙牙周膜組織，機(jī)械分離加酶消化法分離培養(yǎng)人正常牙周膜細(xì)胞，采用有限稀釋法克隆培養(yǎng)純化hPDLSC，測算克隆形成率，檢測hPDLSC的體外多向分化潛能。向培養(yǎng)基中添加40 μg/mL維生素C制備hPDLSC膜片，用掃描電鏡及HE染色觀察所制備的hPDLSC膜片的結(jié)構(gòu)。結(jié)果 hPDLSC具有較高的克隆形成率，體外誘導(dǎo)具有成骨成脂多向分化潛能。HE染色顯示hPDLSC膜片由3、4層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，富含細(xì)胞外基質(zhì)。掃描電鏡顯示hPDLSC膜片中hPDLSC排列緊密，細(xì)胞外基質(zhì)豐富。結(jié)論 成功制備了hPDLSC膜片。

牙周膜干細(xì)胞；細(xì)胞膜片；組織再生

牙周病是口腔臨床一種常見疾病，常引起各種程度的口腔功能喪失，最終造成牙齒缺失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前傳統(tǒng)的牙周治療方法還不十分理想，牙周治療亟待引入新方法新技術(shù)。近年來，隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展以及對牙周組織再生和發(fā)育機(jī)制的進(jìn)一步了解，通過干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生成為一種可能的牙周病治療方式[1]。牙周膜干細(xì)胞(PDLSC)是一種牙源性的間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下能夠多向分化為牙周組織相關(guān)性細(xì)胞，如成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，是一種可以用于牙周組織再生的干細(xì)胞[2]。但目前對于PDLSC在牙周再生中的應(yīng)用尚存在一些問題，具體表現(xiàn)為缺乏良好的種子細(xì)胞復(fù)合生物性支架材料、傳統(tǒng)支架材料復(fù)合干細(xì)胞植入操作困難、移植后種子細(xì)胞的存活率低等[3]。細(xì)胞膜片技術(shù)是近年來新興的一項(xiàng)組織工程學(xué)技術(shù)，不同于傳統(tǒng)的種子細(xì)胞復(fù)合支架材料模式，細(xì)胞膜片技術(shù)采用非酶解的方式獲取干細(xì)胞，最大程度保留了細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，其中含有的豐富的生長因子和信號分子可以促進(jìn)干細(xì)胞生物學(xué)特性的發(fā)揮，目前已廣泛用于心肌組織、角膜、骨組織以及牙周組織再生中[4]。近年來發(fā)現(xiàn)，將PDLSC膜片應(yīng)用于牙周缺損的修復(fù)時(shí)，PDLSC膜片能夠良好地再生牙周膜-牙骨質(zhì)復(fù)合體，但是膜片的獲取存在一些問題，如利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿制備膜片時(shí)成功率較低、膜片厚度不夠、操作不夠便捷以及成本較高等[5,6]。因此，本研究采用維生素C對人PDLSC(hPDLSC)進(jìn)行刺激制備hPDLSC膜片?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-抗壞血酸2-磷酸、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、Ⅰ型膠原酶、Dispase、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、堿性磷酸酶染色試劑盒。

1.2 hPDLSC分離培養(yǎng) 選擇因正畸治療需要拔除前磨牙到濰坊益都中心醫(yī)院口腔科就診的20例患者，年齡16～29歲，全身健康，近期無急慢性感染性疾病，無遺傳病及全身系統(tǒng)性疾病史。經(jīng)患者知情同意后收集完整拔除的前磨牙，PBS液沖洗，刮取牙根中段1/3區(qū)域的牙周膜組織。組織經(jīng)PBS反復(fù)沖洗，組織剪剪碎，置于含3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL的Dispase的混合液中，37 ℃培養(yǎng)箱消化1 h，過70 μm細(xì)胞篩，離心后重懸，并將細(xì)胞接種在含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液直至細(xì)胞融合達(dá)85%，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.3 hPDLSC的鑒定

1.3.1 克隆形成率計(jì)算 采用有限稀釋法檢測hPDLSC的克隆形成率[7]。原代hPDLSC呈短梭形，胞體豐滿，細(xì)胞核較大，核圓形或卵圓形。將原代培養(yǎng)的細(xì)胞胰酶消化，充分吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，將密度調(diào)整為104/mL，按1 mL/孔接種到100 mm培養(yǎng)皿，加入DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，培養(yǎng)7 d后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，低倍鏡視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞的記作一個(gè)克隆，最后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算克隆形成率。培養(yǎng)7 d后可見細(xì)胞呈集落樣分布，并形成細(xì)胞克隆，傳代后的細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，細(xì)胞之間排列緊密，甲苯胺藍(lán)染色顯示克隆形成率為0.52%±0.04%。

1.3.2 多向分化能力鑒定 ①成骨誘導(dǎo)分化能力：將處于對數(shù)生長期的第2、3代hPDLSC消化并制備為細(xì)胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞增殖至60%左右時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松和50 mg/L維生素C、15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)3周，每3 d換液1次。成骨誘導(dǎo)1周后，PBS清洗細(xì)胞，將細(xì)胞用95%乙醇固定2 min，PBS清洗2次，利用堿性磷酸酶染色試劑盒進(jìn)行染色，并進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測，可見堿性磷酸酶染色明顯陽性，堿性磷酸酶活性明顯增高。在誘導(dǎo)3周后，棄誘導(dǎo)液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，進(jìn)行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，可見大量鈣結(jié)節(jié)形成。②成脂誘導(dǎo)分化能力：將處于對數(shù)生長期的第2、3代hPDLSC制備成細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%融合時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)液(含0.5 mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、10 μg/mL胰島素、0.5 μmol/L氫化可的松、60 μmol/L吲哚美辛、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)并誘導(dǎo)4周，每3 d換液1次，誘導(dǎo)3、4周后進(jìn)行油紅-O染色，結(jié)果顯示為陽性。

1.4 hPDLSC膜片的制備 將處于對數(shù)生長期的第3代或第4代hPDLSC用胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×105/mL，將細(xì)胞均勻接種至100 mm培養(yǎng)皿，加入10 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含40.0 μg/mL維生素C、5 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基)，每2 d換液，培養(yǎng)10～14 d，連續(xù)動態(tài)觀察膜片成熟過程。培養(yǎng)皿底部出現(xiàn)白色膜樣物質(zhì)，邊緣出現(xiàn)皺褶，說明hPDLSC膜片已形成。將所獲取的hPDLSC膜片用PBS沖洗，在4 ℃下用4%多聚甲醛固定6 h、梯度乙醇脫水、浸蠟，包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。將獲得的完整的hPDLSC膜片用二甲砷酸鈉緩沖液(pH 7.2)沖洗3次，4 ℃下1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗3次后，梯度乙醇依次脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴金鍍膜，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

培養(yǎng)7 d時(shí)，倒置相差顯微鏡下可見hPDLSC排列非常緊密，呈多層交織狀排列，細(xì)胞接觸抑制消失，細(xì)胞外有大量的細(xì)胞外基質(zhì)；14 d時(shí)，肉眼觀察可見hPDLSC膜片形成，膜片從邊緣開始從培養(yǎng)皿分離，用細(xì)胞刮刀可以將其從培養(yǎng)皿周邊刮起，最后可獲得完整的hPDLSC膜片。HE染色顯示hPDLSC膜片由3、4層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，富含細(xì)胞外基質(zhì)。掃描電鏡顯示hPDLSC膜片中hPDLSC排列緊密，細(xì)胞外基質(zhì)豐富。

3 討論

PDLSC在2004年首先被發(fā)現(xiàn)，研究[2]表明該類細(xì)胞具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠在體外分化成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和牙槽骨細(xì)胞。并具有較強(qiáng)的骨向分化潛能。成骨相關(guān)基因如OCN、ALP、ON、BSP、Col-1等都在PDLSC上有表達(dá)[8]，提示PDLSC在牙周組織的再生以及骨組織的再生中可以發(fā)揮重要作用。PDLSC在牙周組織工程中一直被認(rèn)為是最理想的種子細(xì)胞之一，以往的研究發(fā)現(xiàn)小鼠及大鼠的PDLSC難以大量擴(kuò)增[9]，但本研究成功分離培養(yǎng)出hPDLSC，證實(shí)這些克隆化生長的PDLSC在第4代時(shí)仍有一定的克隆形成能力，且具有間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能。

合理有效的細(xì)胞移植方式在組織再生中具有重要的作用，影響PDLSC介導(dǎo)的牙周組織再生效果因素有很多[10]，其中干細(xì)胞與支架材料的低生物相容性能降低PDLSC生物學(xué)功能。目前常見的組織工程技術(shù)多是細(xì)胞復(fù)合支架材料的方式，這種傳統(tǒng)的方式往往采用胰酶消化方法來獲取干細(xì)胞，造成了大量的細(xì)胞間信號分子和細(xì)胞間連接的破壞，影響種子細(xì)胞植入后的存活及組織再生效果。同時(shí)作為細(xì)胞植入載體所使用的天然或人工合成材料在體內(nèi)移植和降解過程中均會不同程度地引發(fā)局部組織的免疫反應(yīng)和毒性反應(yīng)，也能影響組織再生效果。因而，近些年來研究者開始尋找不需要支架的組織再生方式進(jìn)行組織再生。細(xì)胞膜片技術(shù)最大程度保留了細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞連接，更好地模擬了細(xì)胞的生存微環(huán)境，且避免了外源性支架材料的使用，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景[11]。細(xì)胞外基質(zhì)是位于組織中細(xì)胞之間的多種成分，包含大量生物活性分子，能夠調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能，是維持正常組織生理功能的重要部分[12,13]。目前制備細(xì)胞膜片的方式有許多種，但都有不足。其中常見及簡便的方式是使用維生素C進(jìn)行刺激[14]，維生素C是機(jī)體內(nèi)維持生物學(xué)功能的重要的協(xié)同因子，它可以促進(jìn)細(xì)胞分泌膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)[15]，在機(jī)體的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，維生素C能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖和DNA合成，抑制細(xì)胞分化[16]，抑制端粒酶活性從而減少凋亡，并且能夠上調(diào)胚胎干細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4和Sox2[17]。目前尚未有研究報(bào)道利用維生素C制備人來源PDLSC膜片。本實(shí)驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中添加40 μg/mL維生素C進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)hPDLSC從第3天就能明顯增殖，有大量細(xì)胞外基質(zhì)分泌，第7天能見到細(xì)胞呈多層交織狀排列，第14天左右膜片成熟，所獲得的膜片不易破損，具有一定物理性能。

[1] Requicha JF, Viegas CA, Munoz F, et al. A tissue engineering approach for periodontal regeneration based on a biodegradabledouble-layer scaffold and adipose-derived stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2014,20(17-18):2483-2492.

[2] Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J]. Lancet, 2004,364(9429):149-155.

[3] Sculean A, Nikolidakis D, Schwarz F. Regeneration of periodontal tissues:combinations of barrier membranes and grafting materials - biological foundation and preclinical evidence: a systematic review[J]. Clin Periodontol, 2008,35(8 Suppl):106-116.

[4] Chen G, Qi Y, Niu L, et al. Application of the cellsheet technique in tissue engineering[J]. Biomed Rep， 2015,3(6):749-757.

[5] Ishikawa I, Iwata T, Washio K, et al. Cellsheet engineering and other novel cell-based approaches to periodontalregeneration[J]. Periodontol， 2009,51:220-238.

[6] Iwata T, Yamato M, Tsuchioka H, et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J]. Biomaterials, 2009,30(14):2716-2723.

[7] 高秦,劉宏偉,金巖,等.人牙周膜干細(xì)胞的體外分離、純化及初步鑒定[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(1):34-37.

[8] Nagatomo K, Komaki M, Sekiya I, et al. Stem cell properties of human periodontal ligament cells[J]. Periodontal Res, 2006,41(4):303-310.

[9] 常秀梅,劉宏偉,金巖.牙周膜干細(xì)胞的研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(7):440-442.

[10] 唐亮,金巖.影響牙周膜干細(xì)胞功能的重要因素[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(5):737-740.

[11] Kelm JM, Fussenegger M. Scaffold-free cell delivery for use in regenerative medicine[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2010,62(7-8):753-764.

[12] Daley WP, Yamada KM. ECM-modulated cellular dynamics as a driving force for tissue morphogenesis[J]. Curr Opin Genet Dev, 2013,23(4):408-414.

[13] Rozario T, De Simone DW. The extracellular matrix in development andmorphogenesis: a dynamic view[J]. Dev Biol, 2010,341(1):126-140.

[14] Wei F, Qu C, Song T, et al.Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity[J]. Cell Physiol, 2012,227(9):3216-3224.

[15] Barnes MJ. Function of ascorbic acid in collagen metabolism[J]. Ann N Y Acad Sci, 1975,30(258):264-277.

[16] Choi KM, Seo YK, Yoon HH, et al. Effect of ascorbic acid on bone marrow-derived mesenchymal stem cell proliferation and differentiation[J]. Biosci Bioeng, 2008,105(6):586-594.

[17] Potdar PD, D′Souza SB. Ascorbic acid induces in vitro proliferation of human subcutaneous adipose tissue derived mesenchymal stem cells with upregulation of embryonic stem cell pluripotency markers Oct4 and SOX2[J]. Hum Cell, 2010,23(4):152-155.

Preparation of human periodontal ligament stem cell sheet

ZHAOLuming,YANGYucheng,WEILimei,DINGGang

(YiduCentralHospitalofWeifang,Qingzhou262500,China)

Objective To prepare the human periodontal ligament stem cell (hPDLSC) sheet. Methods Human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured from 20 extracted premolar teeth. ALP staining and red oil O staining were utilized to observe the differential ability of hPDLSC. hPDLSC sheet was prepared by adding 40 μg/mL vitamin C into the culture medium, HE and SEM were used to observe the cell sheet structure. Results In this study, hPDLSC was successfully isolated and cultured; it had high colonic ability and multiple differentiation ability which complied with the characteristics of mesenchymal stem cells. SEM indicated that the cells were arranged closely, and the extracellular matrix was abundant. HE staining showed that the cell sheet was composed of 3 to 4 layers of cells. Cells and cells were closely connected, and rich in extracellular matrix.Conclusion hPDLSC sheet was prepared successfully.

periodontal ligament stem cells; cell sheet; tissue regeneration

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81570945);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015ZRB14109)。

丁剛(E-mail: dentistdg@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.014

R781.4

A

1002-266X(2016)35-0045-03

2016-04-09)