夏芬，胡燕玲，李莉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

?

轉(zhuǎn)染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細(xì)胞遷移、侵襲能力及EGFR表達(dá)變化

夏芬，胡燕玲，李莉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢 430014)

目的 觀察轉(zhuǎn)染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細(xì)胞遷移、侵襲能力及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)變化。方法 將卵巢癌ES-2細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，觀察組轉(zhuǎn)染miR-7 類似物，對(duì)照組轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用real-time PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-7，用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞遷移能力，用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力，用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞中EGFR蛋白，用real-time PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中EGFR mRNA。結(jié)果 觀察組、對(duì)照組miR-7相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.21、0.13±0.02，劃痕愈合率分別為35.32%±5.43%、84.21%±4.35%，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(149±28)、(532±54)個(gè)，EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.27±0.31、3.65±0.67，EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.04、0.57±0.15,兩組比較，P均<0.05。結(jié)論 轉(zhuǎn)染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細(xì)胞miR-7表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞遷移及侵襲能力下降、EGFR蛋白及mRNA表達(dá)降低；推測(cè)miR-7表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞遷移及侵襲能力的下降，miR-7的這一作用是通過(guò)下調(diào)EGFR表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

微小RNA-7；基因轉(zhuǎn)染；卵巢癌；卵巢癌細(xì)胞系ES-2；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；表皮生長(zhǎng)因子受體

卵巢癌是婦科惡性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在腫瘤致死性疾病中排第5位[1]。轉(zhuǎn)移仍是卵巢癌復(fù)發(fā)和患者死亡的主要原因，深入闡明卵巢癌遷移和侵襲的分子機(jī)制對(duì)提高卵巢癌診治水平具有重要意義。microRNAs(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可與靶基因的mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解[2],廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)過(guò)程[3,4]。miR-7由23個(gè)核苷酸組成，是一種miRNA。miR-7已被發(fā)現(xiàn)與許多原癌基因,如胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、p21活化激酶1和相關(guān)的cdc42激酶1等的調(diào)控有關(guān)[5～7]。卵巢癌組織中miR-7表達(dá)下調(diào)，但miR-7對(duì)卵巢癌遷移、侵襲能力的影響及其機(jī)制尚不明確。2014年2月～2016年1月，我們觀察了轉(zhuǎn)染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細(xì)胞遷移、侵襲能力及EGFR表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌ES-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)corning公司，Western blotting試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，所用一抗購(gòu)自Abcam公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，miR-7類似物、無(wú)關(guān)序列由廣州銳博生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ES-2細(xì)胞分組與miR-7類似物轉(zhuǎn)染 將ES-2細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)期后，兩組細(xì)胞分別采用Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染miR-7類似物、無(wú)關(guān)序列，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)原條件培養(yǎng)24 h。

1.2.2 ES-2細(xì)胞miR-7檢測(cè) 采用real-time PCR法。采用TRIzol試劑提取上述兩組細(xì)胞總RNA，cDNA通過(guò)Superscript Ⅱ Reverse Transcriptase (Invitrogen公司)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成。熒光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，使用ABI公司的熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。以U6作為內(nèi)參，正向引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6小核RNA作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示miR-7的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 ES-2細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將對(duì)照組和觀察組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待生長(zhǎng)融合后，用100 μL的滅菌吸引槍頭沿直線用力劃直線，于劃痕后即刻、劃痕后48 h在顯微鏡下測(cè)算細(xì)胞劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 ES-2細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組和觀察組各取2×104個(gè)細(xì)胞，種于Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoatTM包被Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出上層小室，將膜下面的細(xì)胞與1%多聚甲醛混合，用0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min。用顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)目，在200倍鏡頭下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 ES-2細(xì)胞EGFR檢測(cè) ①EGFR蛋白：采用Western blotting法。收集對(duì)照組和觀察組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白后，以每孔30 μg總蛋白上樣，電泳、濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入EGFR一抗(1∶200)和GAPDH(1∶300)孵育過(guò)夜，加入二抗1∶1 000孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Quantity One 1-D分析軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)測(cè)定蛋白灰度值。以目的蛋白測(cè)定值與GAPDH的比值作為EGFR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。②EGFR mRNA：采用real-time PCR法。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。EGFR正向引物:5′-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3′，反向引物：5′-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3′。內(nèi)參β-actin正向引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物：3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。以β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

觀察組、對(duì)照組miR-7相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.21、0.13±0.02，劃痕愈合率分別為35.32%±5.43%、84.21%±4.35%，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(149±28)、(532±54)個(gè)，EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.27±0.31、3.65±0.67，EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.04、0.57±0.15，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

侵襲與轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，主要是原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，侵襲穿過(guò)基底膜并向周圍間質(zhì)浸潤(rùn)，進(jìn)入毛細(xì)血管或淋巴管并隨血液循環(huán)定植于遠(yuǎn)處器官，形成轉(zhuǎn)移灶。上述過(guò)程復(fù)雜，受一系列轉(zhuǎn)移基因、抑制轉(zhuǎn)移基因、腫瘤新生血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解、黏附、腫瘤微環(huán)境等因素影響[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，miRNA能通過(guò)靶向多種原癌基因與抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。miR-7首次于2001年由Lagos-Quintana等[10]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，由23個(gè)核苷酸組成。Kong等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-7與E-鈣黏蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與波形蛋白Vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并可通過(guò)靶向FAK基因表達(dá)抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Reddy等[12]報(bào)道m(xù)iR-7可通過(guò)靶向下調(diào)PAK1的表達(dá)，并進(jìn)而抑制乳腺癌的生長(zhǎng)。Webster等[13]報(bào)道m(xù)iR-7可通過(guò)靶向抑制EGFR的表達(dá)和蛋白激酶B信號(hào)通路，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Chan等[14]報(bào)道m(xù)iR-7可通過(guò)靶向結(jié)合EGFR mRNA的3′-UTR區(qū)抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Liu等[15]報(bào)道m(xù)iR-7可通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR信號(hào)通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤形成。近期研究[16]也表明，約70%的卵巢上皮癌表達(dá)活化的EGFR。EGFR的過(guò)度表達(dá)和活化導(dǎo)致了癌細(xì)胞的增殖和遷移，其中包括卵巢癌。EGFR酪氨酸激酶的激活導(dǎo)致了許多胞內(nèi)信號(hào)激活，通過(guò)其下游信號(hào)通路，如蛋白激酶(AKT)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)等，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、血管增生、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組卵巢癌ES-2細(xì)胞miR-7相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示轉(zhuǎn)染miR-7類似物可以上調(diào)卵巢癌ES-2細(xì)胞miR-7表達(dá)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，觀察組劃痕愈合率及穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組，表明轉(zhuǎn)染miR-7類似物可抑制卵巢癌的遷移及侵襲。觀察組卵巢癌ES-2細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白顯著低于對(duì)照組，提示miR-7與EGFR可能呈負(fù)相關(guān)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-7可在乳腺癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中靶向結(jié)合并下調(diào)EGFR的表達(dá)[6,13,14]，故miR-7抑制卵巢癌遷移和侵襲的作用機(jī)制很可能是通過(guò)靶向調(diào)節(jié)EGFR表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。這與前人在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究結(jié)果相一致。如Kefas等[6]在活體細(xì)胞培養(yǎng)和異體腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-7過(guò)表達(dá)均可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲。Webster等[13]發(fā)現(xiàn)miR-7能作用于EGFR的3′-UTR區(qū)域從而抑制其基因表達(dá)。

綜上可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-7類似物的卵巢癌ES-2細(xì)胞miR-7表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞遷移及侵襲能力下降、EGFR蛋白及mRNA表達(dá)降低；推測(cè)miR-7表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞遷移及侵襲能力的下降，miR-7的這一作用是通過(guò)下調(diào)EGFR表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] 賈磊,李兆鳳.miRNA及其臨床作用的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2012,52(15):89-91.

[3] 葉振南,徐善水.miRNA在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及作用[J].山東醫(yī)藥,2013,53(33):100-102.

[4] Liu W, Gong YH, Chao TF, et al. Identification of differentially expressed microRNAs by microarray: a possible role for microRNAs gene in medulloblastomas[J]. Chin Med J (Engl)， 2009,122(20):2405-2411.

[5] Zhao X, Dou W, He L, et al. MicroRNA-7 functions as an anti-metastatic microRNA in gastric cancer by targeting insulin-like growth factor-1 receptor[J]. Oncogene, 2013,32(11):1363-1372.

[6] Kefas B, Godlewski J, Comeau L, et al. microRNA-7 inhibits the epidermal growth factor receptor and the Akt pathway and is down-regulated in glioblastoma[J]. Cancer Res, 2008,68(10):3566-3572.

[7] Saydam O, Senol O, Würdinger T, et al. miRNA-7 attenuation in Schwannoma tumors stimulates growth by upregulating three oncogenic signaling pathways[J]. Cancer Res, 2011,71(3):852-861.

[8] 馬齊襄,朱曉丹,胡凱文,等.腫瘤轉(zhuǎn)移的種子與土壤學(xué)說(shuō)新認(rèn)識(shí)[J].腫瘤防治研究,2015，43(10):1049-1053.

[9] Clop A, Marcq F, Takeda H, et al. A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep[J]. Nat Genet, 2006,38(7):813-818.

[10] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science, 2001,294(5543):853-858

[11] Kong X, Li G, Yuan Y, et al. MicroRNA-7 inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer cells via targeting FAK expression[J]. PLoS One, 2012,7(8):e41523.

[12] Reddy SD, Ohshiro K, Rayala SK, et al. MicroRNA-7, a homeobox D10 target, inhibits p21-activated kinase 1 and regulates its functions[J]. Cancer Res, 2008,68(20):8195-8200.

[13] Webster RJ, Giles KM, Price KJ, et al. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling in human cancer cells by microRNA-7[J]. J Biol Chem, 2009,284(9):5731-5741

[14] Chan LW, Wang FF, Cho WC. Genomic sequence analysis of EGFR regulation by microRNAs in lung cancer[J]. Curr Top Med Chem, 2012,12(8):920-926.

[15] Liu Z, Jiang Z, Huang J, et al. miR-7 inhibits glioblastoma growth by simultaneously interfering with the PI3K/ATK and Raf/MEK/ERK pathways[J]. Int J Oncol, 2014,44(5):1571-1580.

[16] Nicholson RI, Gee JM, Harper ME. EGFR and cancer prognosis[J]. Eur J Cancer, 2001,37:9-15.

[17] Gan Y, Shi C, Inge L, et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells[J]. Oncogene, 2010,29(35):4947-4958.

李莉(E-mail: liliwuhan8887@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.009

R737.31

A

1002-266X(2016)35-0030-03

2016-03-16)