葉園英，黃煜，顏莉莉，趙淑萍，張磊，劉倩倩

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2青島大學(xué))

?

·基礎(chǔ)研究·

人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

葉園英1,2，黃煜1,2，顏莉莉2，趙淑萍1,2，張磊1，劉倩倩1,2

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2青島大學(xué))

目的 建立人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型。方法 培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，制成腫瘤細(xì)胞懸液，于裸鼠(10只)右側(cè)肩胛背部皮下注射，每只裸鼠注射約1×107個(gè)細(xì)胞。接種后每日觀察裸鼠精神、活動(dòng)、飲食、排便等狀況及是否有腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)速度等。以接種部位可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，若第一次移植失敗則考慮行二次瘤細(xì)胞接種。發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)后每3 d計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤最長(zhǎng)徑達(dá)15 mm或出現(xiàn)皮膚破潰時(shí)，立即處死荷瘤裸鼠；否則于接種第49天將荷瘤裸鼠處死、剝出腫瘤，測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑，稱取瘤體質(zhì)量。取腫瘤組織切片后行HE染色，觀察腫瘤組織病理變化。結(jié)果 有1只裸鼠第一次接種失敗，在第二次接種后移植成功，一次成瘤率為9/10。在接種第40天和第46天各發(fā)現(xiàn)1只裸鼠瘤體表面皮膚破潰，發(fā)現(xiàn)后脫頸處死荷瘤裸鼠，測(cè)得腫瘤最長(zhǎng)徑分別為12.2、12.6 mm，腫瘤體積分別為505.14、510.30 mm3，腫瘤質(zhì)量分別為0.88、0.86 g；至接種第49天，存活的7只裸鼠移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損，處死裸鼠后完整剝離腫瘤，測(cè)得腫瘤最長(zhǎng)徑為11.7～14.0 mm，瘤重0.86～1.23 g。取移植瘤組織進(jìn)行病理檢查，腫瘤組織大體表現(xiàn)與鏡下表現(xiàn)符合人子宮內(nèi)膜癌的特點(diǎn)。結(jié)論 采用將Ishikawa細(xì)胞株接種于裸鼠右側(cè)肩胛皮下的方式成功建立人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，且移植瘤組織和細(xì)胞保留了人子宮內(nèi)膜癌的病理特征。

子宮內(nèi)膜癌；Ishikawa細(xì)胞株；子宮內(nèi)膜癌移植瘤；動(dòng)物模型

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，病死率僅次于卵巢癌，發(fā)病率逐年上升[1，2]。子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌最常見的病理類型，多見于絕經(jīng)后女性[3]。近年來對(duì)子宮內(nèi)膜癌的基礎(chǔ)與臨床研究發(fā)展迅速，建立合適的動(dòng)物模型對(duì)研究子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為及進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)治療具有重要意義。雖然國(guó)內(nèi)外有學(xué)者已成功建立子宮內(nèi)膜癌移植瘤動(dòng)物模型，但各項(xiàng)研究中腫瘤細(xì)胞種系的選擇、具體接種數(shù)量或濃度及實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有所差異[4～9]。本研究采用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系瘤細(xì)胞懸液接種法構(gòu)建裸鼠子宮內(nèi)膜癌皮下移植瘤模型，方法簡(jiǎn)單易于操作，易于對(duì)腫瘤進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察與記錄?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)裸小鼠(BALB/c)10只，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量16～18 g，飼養(yǎng)條件:SPF級(jí)，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每日光照12 h。有關(guān)實(shí)驗(yàn)程序由青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa購(gòu)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于 5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 子宮內(nèi)膜癌移植瘤模型的建立 待Ishikawa細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(鋪滿培養(yǎng)瓶底75%～85%)，棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2次后0.25%胰蛋白酶消化，收集后1 000 r/min離心5 min，適量PBS重懸細(xì)胞，取少量做細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成5×107/mL腫瘤細(xì)胞懸液，備接種用。無菌條件下抽取瘤細(xì)胞懸液于裸鼠右側(cè)肩胛背部皮下注射，每只裸鼠注射0.2 mL(約含1×107個(gè)細(xì)胞)。接種時(shí)注意針頭于皮下潛行1 cm左右再注射，注射完畢拔出針頭，囑助手用無菌棉棒輕摁注射點(diǎn)，避免瘤細(xì)胞從針孔漏出。

1.3 裸鼠生活情況及腫瘤生長(zhǎng)情況觀察 裸鼠接種腫瘤細(xì)胞后繼續(xù)于SPF級(jí)層流室內(nèi)飼養(yǎng)，每天觀察其精神、活動(dòng)、飲食、排便等狀況及是否有腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)速度等。以接種部位可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，若第一次移植失敗后可酌情考慮行二次瘤細(xì)胞接種。發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)后每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，根據(jù)公式腫瘤體積=(a×b2)/2計(jì)算腫瘤體積。以接種4周(接種第28天)腫塊最長(zhǎng)徑達(dá)5 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，觀察成瘤情況。當(dāng)腫瘤最長(zhǎng)徑達(dá)15 mm或出現(xiàn)皮膚破潰時(shí)，立即處死荷瘤裸鼠；否則于接種后第49天將荷瘤裸鼠處死，小心完整剝出腫瘤，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑，同時(shí)用電子稱稱取瘤體質(zhì)量。

1.4 腫瘤組織病理觀察 腫瘤組織經(jīng)4%甲醛溶液固定48 h后常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片后行HE染色，常規(guī)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 成瘤情況及腫瘤生長(zhǎng)情況 有1只裸鼠第一次接種失敗，在第二次接種后第6天即出現(xiàn)腫瘤小結(jié)節(jié)，移植成功率為100%。Ishikawa細(xì)胞接種后各裸鼠注射部位均可見皮下小隆起，略有腫脹、紅斑，質(zhì)軟，至1周左右后可完全吸收消失。腫瘤細(xì)胞接種后2周，有9只裸鼠接種部位處可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬。本組成瘤率為9/10。自接種第28天開始，腫瘤體積逐漸增大。在接種第40天和第46天各發(fā)現(xiàn)1只裸鼠瘤體表面皮膚破潰，發(fā)現(xiàn)后脫頸處死荷瘤裸鼠，超凈工作臺(tái)上剝出腫瘤，測(cè)得腫瘤最長(zhǎng)徑分別為12.2、12.6 mm，腫瘤體積分別為505.14、510.30 mm3，腫瘤質(zhì)量分別為0.88、0.86 g；至接種第49天，存活的7只裸鼠移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損，處死裸鼠后完整剝離腫瘤，測(cè)得腫瘤最長(zhǎng)徑為11.7～14.0 mm，腫瘤質(zhì)量0.86～1.23 g。

2.2 移植瘤大體觀察及病理檢查 肉眼觀察見移植瘤呈圓形或橢圓形，多數(shù)移植瘤與周圍組織輕度粘連，未侵及皮膚，容易剝離，但其中出現(xiàn)皮膚破潰的兩個(gè)移植瘤與瘤體皮膚貼合緊密，已侵及皮膚，剝離時(shí)較為困難；腫塊質(zhì)地中等，將瘤體切開，剖面呈灰白色，個(gè)別體積較大的移植瘤中央?yún)^(qū)域可見小量膿液樣壞死物流出。光鏡下見腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞分布致密、排列紊亂，腫瘤細(xì)胞大、胞質(zhì)豐富、核大深染、核仁肥大且數(shù)目增多，病理性核分裂象多見。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在婦科惡性腫瘤中其病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌，單純依靠改進(jìn)手術(shù)方式和技巧難以提高生存率，尤其是對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者。而放療和藥物治療效果有一定局限性，且不良反應(yīng)較重。近年來子宮內(nèi)膜癌治愈率的提高主要依賴于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。子宮內(nèi)膜癌動(dòng)物模型是探索子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)特征、治療方法或評(píng)估療效的重要研究工具。

建立子宮內(nèi)膜癌移植瘤動(dòng)物模型主要包括組織塊移植和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株接種兩種方法。賈玖麗等[10]比較了兩種方法建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型的效果，證實(shí)Ishikawa細(xì)胞株接種和移植瘤組織移植均保留了人子宮內(nèi)膜癌的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)特性，成瘤率分別為80%和100%。雖然手術(shù)切除標(biāo)本移植腫瘤更接近人子宮內(nèi)膜癌的病理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但建模周期長(zhǎng)、難度大、成瘤率低。盛修貴等[11]進(jìn)行了14例手術(shù)標(biāo)本移植，移植成功率僅為42.9%。本實(shí)驗(yàn)選擇4～5周齡裸鼠，此時(shí)NK細(xì)胞活性低，移植容易成功。我們采用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系懸液接種法，操作簡(jiǎn)單方便，接種部位在裸鼠右側(cè)肩胛背部，易于觀察和測(cè)量，同時(shí)能避免裸鼠撓抓。

本研究中，9只裸鼠一次移植成功，1只首次接種失敗，我們考慮原因可能與細(xì)胞活力降低、細(xì)胞接種分散及裸鼠自身因素有關(guān)。由于一次性接種10只裸鼠，處理好的腫瘤細(xì)胞不能及時(shí)接種于裸鼠體內(nèi)，處于饑餓狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞活性可能會(huì)有所下降。行腫瘤細(xì)胞接種時(shí)，雖然每只裸鼠的接種細(xì)胞量一致，但有個(gè)別裸鼠注射后形成的皮丘較大，可能是由于注射的瘤細(xì)胞相對(duì)較為分散。我們?cè)谛卸谓臃N時(shí)，接種方法、部位、瘤細(xì)胞數(shù)量和濃度均同前，于第二次接種后第6天在接種部位見瘤結(jié)節(jié)，該時(shí)間明顯短于第一次接種移植瘤潛伏時(shí)間(2周左右)，我們猜想可通過分次接種來縮短成瘤時(shí)間，這樣能避免盲目增加接種細(xì)胞量或細(xì)胞濃度導(dǎo)致裸鼠發(fā)生意外死亡。我們進(jìn)行第二次接種時(shí)裸鼠已達(dá)8周齡左右，NK細(xì)胞已具有較高活性，但仍能在較短時(shí)間內(nèi)成瘤，可能與裸鼠體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞使免疫力降低有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，二次接種的移植瘤的生長(zhǎng)速度與其他裸鼠移植瘤一致，且荷瘤裸鼠生活狀況良好，未出現(xiàn)意外死亡現(xiàn)象。

我們發(fā)現(xiàn)，建模小鼠在接種第28天前雖可見或觸及小瘤結(jié)節(jié)，但由于腫塊體積較小，且生長(zhǎng)較為緩慢，測(cè)量誤差較大；而接種第28天后各移植瘤均明顯突起于皮膚表面，易于測(cè)量，人為因素造成的誤差相對(duì)較小，因此我們將腫瘤體積增長(zhǎng)曲線中的起始數(shù)據(jù)取自接種第28天。本實(shí)驗(yàn)中有2只裸鼠移植瘤體表面皮膚出現(xiàn)破潰現(xiàn)象，導(dǎo)致無法按照預(yù)先計(jì)劃進(jìn)行處死。我們?cè)趧兂瞿[瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與皮膚貼合緊密，已侵及皮膚，考慮到兩個(gè)移植瘤體積均較大，分析移植瘤體皮膚破潰可能與接種瘤細(xì)胞時(shí)的注射位置較為表淺或腫瘤生長(zhǎng)過快有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ishikawa細(xì)胞株在裸鼠右側(cè)肩胛背部生長(zhǎng)良好，所有裸鼠均未出現(xiàn)惡病質(zhì)或意外死亡。我們認(rèn)為，如需在裸鼠體內(nèi)研究子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為特征、評(píng)估藥物療效，將Ishikawa細(xì)胞株接種于裸鼠右側(cè)肩胛皮下部位是可行的，且移植瘤組織中的腫瘤細(xì)胞保持了人類子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的病理學(xué)特征，為子宮內(nèi)膜癌的基礎(chǔ)研究、臨床治療和療效判斷提供了可靠工具。

[1] 謝幸,茍文麗,林仲秋,等.婦產(chǎn)科學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:313.

[2] Deng L, Gao Y, Li X, et al. Expression and clinical significance of annexin A2and human epididymis protein 4 in endometrial carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2015,34:96.

[3] Legro RS, Kunselman AR, Miller SA, et al. Role of androgens in the growth of endometrial carcinoma: an in vivo animal model[J]. Am J Obstet Gynecol, 2001,184(3):303-308.

[4] Xu Y, Tong J, Ai Z, et al. Epidermal growth factor receptor signaling pathway involved in progestin-resistance of human endometrial carcinoma: In a mouse model[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2012,38(12):1358-1366.

[5] Jiang F, Liu T, He Y, et al. MiR-125b promotes proliferation and migration of type Ⅱ endometrial carcinoma cells through targeting TP53INP1 tumor suppressor in vitro and in vivo[J]. BMC Cancer, 2011,11:425.

[6] Oh JH, Lee HS, Park SH, et al. Syndecan-1 overexpression promotes tumor growth and angiogenesis in an endometrial cancer xenograft model[J]. Int J Gynecol Cancer, 2010,20(5):751-756.

[7] Jiang T, Chen N, Zhao F, et al. High levels of Nrf2 determine chemoresistance in type Ⅱ endometrial cancer[J]. Cancer Res, 2010,70(13):5486-5496.

[8] Depreeuw J, Hermans E, Schrauwen S, et al. Characterization of patient-derived tumor xenograft models of endometrial cancer for preclinical evaluation of targeted therapies[J]. Gynecol Oncol, 2015,139(1):118-126.

[9] Matsuzaki S, Enomoto T, Serada S, et al. Annexin A4-conferred platinum resistance is mediated by the copper transporter ATP7A[J]. Int J Cancer, 2014,134(8):1796-1809.

[10] 賈玖麗,馬曉欣.兩種不同子宮內(nèi)膜癌動(dòng)物模型穩(wěn)定性的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(8):1695-1698.

[11] 盛修貴,孫建衡,周春曉,等.人子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型的建立及其生物學(xué)特性的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(1):33-35.

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金資助項(xiàng)目(BS2009SW002)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013HM012)。

黃煜(E-mail: huangyuqd@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.008

R737.33

A

1002-266X(2016)35-0028-03

2016-04-08)