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生物反應(yīng)器生產(chǎn)狂犬病疫苗的工藝應(yīng)用

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狂犬病是一種致死率非常高的人畜共患病，我國(guó)列為甲類(lèi)傳染病，是重要防控疫病。由于尚無(wú)非常有效的治療方法，因此暴露于該病原后，接種疫苗是最重要預(yù)防措施之一。2015年OIE的狂犬病控制計(jì)劃指出，95%的人狂犬病是由病犬咬傷所致，如果實(shí)現(xiàn)70%以上的犬免疫，可將人的狂犬病發(fā)病率極大降低。與人預(yù)防該病相比，所消耗的費(fèi)用成本節(jié)約近10倍。此外加強(qiáng)狗和野生動(dòng)物狼等易感動(dòng)物免疫是逐漸凈化本病的根本方法。

自從1885年，Louis Pasteur首次用兔腦和脊髓制備了狂犬病弱毒疫苗，成功保護(hù)了第一位狂犬病野毒暴露者。此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不斷改進(jìn)和提高。狂犬病疫苗經(jīng)歷了神經(jīng)組織疫苗，禽胚疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的發(fā)展歷程。

一、狂犬病疫苗毒株及培養(yǎng)基質(zhì)

1.狂犬病疫苗的發(fā)展。最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的動(dòng)物腦和脊髓神經(jīng)組織制備而成。由于其效價(jià)低，免疫產(chǎn)生抗體水平較差，且含有大量神經(jīng)髓磷脂，存在引發(fā)變態(tài)反應(yīng)等缺點(diǎn)。此后，開(kāi)發(fā)出禽胚組織培養(yǎng)狂犬病疫苗。1955年，Peck制備了鴨胚疫苗（DEV）。雖然鴨胚疫苗在生產(chǎn)工藝又有進(jìn)一步改善，引起變態(tài)反應(yīng)的危險(xiǎn)性降低，但仍然表現(xiàn)出免疫后抗體效價(jià)低的特點(diǎn)。第三代疫苗走上歷史舞臺(tái)，將狂犬病病毒適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗，主要包括原代細(xì)胞疫苗、二倍體細(xì)胞疫苗和傳代細(xì)胞疫苗。隨著生產(chǎn)工藝改進(jìn)，第三代疫苗免疫效果好，副反應(yīng)少，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)，肩負(fù)起了目前免疫防控狂犬病的重任。雖然，狂犬病基因工程疫苗也進(jìn)行很多研究，包括重組活載體疫苗、亞單位疫苗和基因疫苗等。

2.狂犬病疫苗毒株。由于狂犬病分布廣泛，各個(gè)國(guó)家和地區(qū)依據(jù)本國(guó)疫情流行情況，培養(yǎng)篩選出不同的狂犬疫苗毒株。應(yīng)用最為廣泛的毒株來(lái)源于3個(gè)疫苗株：1882年從狂犬病病犬脊髓分離并通過(guò)兔體傳代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur 株)；1939年從美國(guó)一個(gè)患病女孩脊髓懸液經(jīng)鼠腦傳代分離，以雞胚傳代的固定毒Flury株；1935年美國(guó)一個(gè)患病犬體內(nèi)分離的SAD株，經(jīng)鼠腦傳代固定毒SAD株。SAD株是弱毒疫苗株，經(jīng)過(guò)分離篩選出的SAD Bern， SAG2， 和SAD B19等毒株，生產(chǎn)弱毒口服疫苗，在歐洲廣泛用于野生動(dòng)物的免疫，取得了明顯的疫病防控效果。為了排除口服弱毒疫苗SAD株免疫動(dòng)物后毒力返強(qiáng)的可能性，進(jìn)行了現(xiàn)有弱毒株基因重組，以用于更換現(xiàn)有的口服弱毒疫苗株。

3.狂犬病疫苗培養(yǎng)基質(zhì)。原代細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠用于較多狂犬病毒株培養(yǎng)?？袢《維AD株、Paris-Pasteur株和aGT株適應(yīng)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)，F(xiàn)lury-LEP株及Flury-HEP在雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)，生產(chǎn)出弱毒疫苗和滅活疫苗，廣泛用于人和動(dòng)物的狂犬病預(yù)防免疫。原代細(xì)胞質(zhì)量有批間差異，存在潛在的病毒等外源因子污染等缺點(diǎn)，應(yīng)用變少。

二倍體細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，具有能夠充分鑒定和標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞種子庫(kù)系統(tǒng)，建立的細(xì)胞庫(kù)可多年用于生產(chǎn)，有利于質(zhì)量控制。但其對(duì)培養(yǎng)條件要求較為苛刻，生產(chǎn)成本也較高，價(jià)格昂貴，獸用疫苗應(yīng)用較少。傳代細(xì)胞與二倍體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)相似，但其易于培養(yǎng)，而得到較為廣泛應(yīng)用。1962年，日本千葉大學(xué)學(xué)者分離培養(yǎng)出非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero），適用于狂犬病毒株CTN、aG和PM株的滅活疫苗生產(chǎn)，用于狂犬病預(yù)防。我國(guó)于1995年開(kāi)始進(jìn)行人用純化Vero細(xì)胞狂犬病疫苗的研制，已有多家生物制品公司獲得了生產(chǎn)文號(hào)。1961年，A．Macpherson和M．G．．P．Stoker 從1日齡倉(cāng)鼠分離出幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK），并培養(yǎng)成為細(xì)胞系。BHK細(xì)胞對(duì)狂犬病病毒敏感性高，增殖培養(yǎng)PM 株、ERA 株SAD株及CTN-181株等毒株。法國(guó)維克用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)（VP12株）生產(chǎn)的犬、貓用狂犬病疫苗，獲得了在法國(guó)生產(chǎn)文號(hào)，并在我國(guó)進(jìn)行了注冊(cè)。在國(guó)內(nèi)，BHK-21傳代細(xì)胞培養(yǎng)HEP-Flury 株生產(chǎn)滅活疫苗，經(jīng)過(guò)安全性和免疫效力檢驗(yàn)合格，NIH檢驗(yàn)達(dá)到2IU。

二、生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗工藝應(yīng)用

1962年，Capstile成功完成BHK-21細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。1967年，Van Wezel首先開(kāi)創(chuàng)了微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，標(biāo)志生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)的起步。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，其已廣泛用于疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域，因其具有節(jié)約生產(chǎn)所需的空間，生產(chǎn)過(guò)程易于監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、規(guī)?；a(chǎn)，降低批次產(chǎn)品間差異的優(yōu)點(diǎn)。生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗工藝正在被廣泛接受。

狂犬病疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞為貼壁依賴性，包括原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞，適用于生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)。培養(yǎng)類(lèi)型分為微載體懸浮培養(yǎng)和固定床微載體培養(yǎng)。微載體懸浮培養(yǎng)工藝采用攪拌槳式生物反應(yīng)器，能夠懸浮的球狀載體。依據(jù)病毒株和細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)，優(yōu)化狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝，通過(guò)對(duì)反應(yīng)器物理結(jié)構(gòu)等比例放大，應(yīng)用于生產(chǎn)。1984年，法國(guó)Merieun研究所在微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上繁殖狂犬病毒PM1503-3M株，制備出純化Vero細(xì)胞狂犬病疫苗（Purified Vero Rabies Vaccine， PVRV）。該苗免疫原性好、安全、穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)量高，價(jià)格便宜，WHO推薦使用Vero細(xì)胞大量生產(chǎn)狂犬疫苗。攪拌槳生物反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，接入狂犬病PV株種毒，培養(yǎng)出高滴度病毒抗原液，便于下游純化工藝，制備出低成本，免疫效果好的疫苗。Cytodex1微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞，與常規(guī)含血清培養(yǎng)液相比，無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)液更適于Vero細(xì)胞生長(zhǎng)，得到更高效價(jià)抗原液。該工藝的開(kāi)發(fā)，將簡(jiǎn)化下游工藝，降低疫苗副反應(yīng)。

固定床微載體細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器突破原有技術(shù)瓶頸，逐漸擴(kuò)大應(yīng)用范圍。固定床微載體多采用具有一定結(jié)構(gòu)的聚酯纖維載體例如Fibra-Cel disks和BioNOC II Matrix。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Cytodex1載體懸浮培養(yǎng)相比，固定床載體Fibra-Cel disks的培養(yǎng)的細(xì)胞密度更高，單位細(xì)胞產(chǎn)能，病毒產(chǎn)毒量均有提高。固定床生物反應(yīng)器一般具有較低細(xì)胞剪切力，獨(dú)特的暴氣方式和傳質(zhì)效率等特點(diǎn)，形成特有的培養(yǎng)體系。與攪拌槳反應(yīng)器相比，iCELLis固定床生物反應(yīng)器更適于MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)。固定床反應(yīng)器的載體為大孔微載體，存在生物反應(yīng)器逐級(jí)放大和大體積培養(yǎng)的工藝瓶頸，因此更適于致細(xì)胞病變?nèi)醯目袢《局甑纳a(chǎn)。

狂犬病仍是我國(guó)需要防控的致死率高的烈性傳染病，而被患病犬咬傷是主要根源，因此應(yīng)加強(qiáng)與人類(lèi)接觸頻繁的寵物犬和流浪犬等免疫。隨著國(guó)家對(duì)易感動(dòng)物強(qiáng)制接種的力度不斷加大和未來(lái)啟動(dòng)凈化本病，對(duì)狂犬疫苗滅活疫苗和口服弱毒疫苗的需求也會(huì)日益增加。結(jié)合我國(guó)狂犬病獸用疫苗株和細(xì)胞特點(diǎn)，選用合適生物反應(yīng)器建立疫苗抗原生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)出價(jià)格低的優(yōu)質(zhì)病毒抗原液。為保證產(chǎn)品具有穩(wěn)定免疫效力，較高的安全性和最低副反應(yīng)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對(duì)狂犬病疫苗下游濃縮，純化和配苗佐劑的工藝進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，以提供充足有效的狂犬病疫苗。

參考文獻(xiàn)（略）