王騰騰，徐 浩，王擁軍，3，施 杞，梁倩倩＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院 上海 200120）

以腫瘤壞死因子α轉基因小鼠為類風濕關節(jié)炎模型的研究進展＊

王騰騰1，2，徐 浩1，2，王擁軍1，2，3，施 杞1，2，梁倩倩1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院 上海 200120）

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種慢性自身免疫疾病，腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）過表達在本病的發(fā)病過程中起到重要的作用，并介導了多種炎癥因子的表達。目前抗TNF藥物已廣泛應用于RA臨床。過表達人TNF-α的轉基因小鼠可出現(xiàn)類似RA的病理表現(xiàn)：起病緩慢、發(fā)病率高、模型穩(wěn)定。因此，TNF轉基因（TNF-Tg）小鼠模型在RA研究中具有重要的意義，現(xiàn)已廣泛應用于RA的診療技術和病理機制研究，尤其是淋巴管功能的研究，并取得一系列成果。本文針對該模型小鼠的生理病理特征、研究進展進行綜述。

腫瘤壞死因子α 轉基因小鼠 類風濕關節(jié)炎 淋巴

RA是一種以對稱性、多發(fā)性關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性免疫性疾病，主要的病理改變?yōu)椋夯さ脑錾?、炎性因子的浸潤、軟骨及骨組織的破壞等[1]。為研究其病理機制及治療方法，多種動物模型已應用于基礎醫(yī)學研究中。常見模型有誘導型、手術型及轉基因型。誘導型又包括佐劑誘導、蛋白酶誘導及血清誘導等[2]。轉基因模型包括：過表達TNF及其受體、過表達膠原酶、K/BxN轉基因模型等。上述模型已運用于風寒濕型、風濕熱型、脾虛型[3]等中醫(yī)病證結合模型研究中。

隨著抗TNF-α藥物的出現(xiàn)，TNF-Tg小鼠模型已成為常用的研究RA的模型，本文對該動物模型的文獻進行綜述如下。

1 TNF-α在RA中的作用

TNF-α在腫瘤惡病質、內(nèi)毒素休克、器官移植后免疫排斥、自發(fā)性免疫病及RA等多種疾病的進展中起著重要的作用。在RA患者的炎性滑膜、軟骨及血管翳中，TNF-α水平異常升高，TNF-α本身既可引起關節(jié)炎癥，還可引起成纖維細胞樣的滑膜細胞的增生，導致滑膜炎癥；可通過促進膠原酶的產(chǎn)生、抑制關節(jié)軟骨細胞蛋白多糖的合成從而引起軟骨的破壞；或可通過泛素連接酶抑制間充質干細胞向成骨細胞分化[4]、刺激破骨細胞生成、抑制破骨細胞凋亡[5]，或促進前體破骨細胞隨血液循環(huán)進入NF-κB受體激活蛋白配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）高表達水平的滑膜關節(jié)從而引起骨的侵蝕[6,7]。大量研究已經(jīng)證明，在RA中TNF-α位居多種促炎癥因子的上游，抑制TNF-α可以抑制白介素1（Interleukin1，IL-1）、IL-6、IL-8及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF）等其他促炎癥因子。抑制TNF-α幾乎可以緩解所有的RA模型動物的關節(jié)炎癥狀，更進一步證明了TNF-α在RA中的重要作用。Manara等[8]和Catrina等[9]的多中心臨床對照試驗表明抗TNF-α療法可緩解RA患者的關節(jié)炎癥、提高其患肢功能及活動度，減輕軟骨及骨組織的破壞，抗TNF-α療法可促進RA患者滑膜巨噬細胞的凋亡，提高患者關節(jié)功能?；诳筎NF-α的藥物已應用于臨床，常見藥物有依那西普（TNFR2抑制劑）、塞來昔布等。

2 TNF-α的合成及調控

TNF-α因其可促進腫瘤壞死而命名，在急性炎癥反應中，主要由活化的巨噬細胞分泌，T細胞、NK細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、上皮細胞、角質細胞及成纖維細胞均有產(chǎn)生。TNF-α存在跨膜型和分泌型兩種活性形式，作用各不相同[10]。一般認為，跨膜蛋白可在TNF-α轉化酶（Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme，TACE）的作用下，轉化為分泌蛋白，從而發(fā)揮作用。但是，將編碼分泌蛋白1-12號氨基酸的序列敲除，使TNF-α不能分泌，轉基因小鼠依然可表現(xiàn)出關節(jié)炎癥，且抗TNF-α單抗治療有效，TNF轉化酶抑制劑治療無效，證明TNF-α的跨膜蛋白也具有生物活性，在關節(jié)炎癥與骨侵蝕方面也起著重要的作用。

TNF-α主要受其本身mRNA的3’-UTR端的AU富集區(qū)（AU-Rich Element，ARE）的調控。在細胞靜息狀態(tài)下，TNF-α的降解主要由ARE介導，鋅指蛋白36（Tristetraprolin，TTP）也參與了抑制TNF-α的過程。在調控過程正常運行的情況下，TNF-α可介導急性炎癥。若該調控過程發(fā)生紊亂，如：TNF-α過表達及TTP敲除的轉基因小鼠，可發(fā)生慢性炎癥，從而繼發(fā)一系列全身的病理改變。

3 TNF-Tg小鼠模型的生理病理學特點

常見的TNF-Tg小鼠模型1981年于George Kollias實驗室培育成功[11]，利用基因打靶載體，將人TNF基因ARE的3’-UTR端由β球蛋白的3’-UTR端代替，保證了TNF-α的轉錄效率，可使該系小鼠關節(jié)、肺、脾等組織慢性、持續(xù)性過表達人TNF-α。

TNF相關的轉基因小鼠亦存在多種形式。將ARE的3’-UTR端敲除可得到TNFΔARE小鼠[12]，可出現(xiàn)類似克羅恩病的腸炎，關節(jié)炎出現(xiàn)率為100%，全身關節(jié)均受累，該品系小鼠也是第一個顳頜關節(jié)炎模型。但如果把白足小鼠Tnf基因的整個3’-UTR端敲除，可發(fā)展成為強直性脊柱炎而無周圍關節(jié)炎的表現(xiàn)。因人TNF-α只能與TNFR1結合而不能與TNFR2結合，提示在某種程度上，TNFR2可能與RA發(fā)病無關；但是TNFR2敲除會加重TNFΔARE小鼠的關節(jié)炎癥，其在關節(jié)炎癥中的作用有待進一步研究。

常見的無發(fā)育缺陷的TNF-Tg有2個亞型：3647和197。3647品系攜帶人的1個TNF拷貝基因，2月齡開始出現(xiàn)踝關節(jié)腫脹。197品系攜帶5個拷貝基因，4-5周齡出現(xiàn)表型，且癥狀較3647更為嚴重；9-10周齡后肢喪失活動能力，體質量逐漸減輕，純合子的197品系12-14周即死亡。因此，3647品系存活時間長，炎癥進展緩慢，實用性較高，本文重點討論該品系。

3647品系小鼠以C57BL/6VBA為雜交背景，雜合子的雄性與野生型雌性雜交而生，出生雜合子陽性小鼠的概率約為50%。小鼠表現(xiàn)為對稱性、多發(fā)性關節(jié)炎。整個病程都可見滑膜的增生及炎癥細胞的浸潤。病程的晚期可出現(xiàn)軟骨及骨組織的侵蝕，骨的表面出現(xiàn)大量多核抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP）染色陽性的破骨細胞。以上病理表現(xiàn)與RA患者的臨床表現(xiàn)極為相似，但是整個病程中小鼠血清的類風濕因子是陰性的?？筎NF可完全阻斷炎癥的產(chǎn)生，純合子的飼養(yǎng)需要持續(xù)的抗TNF治療。

TNF-Tg小鼠的最大優(yōu)勢在于其病程進展呈現(xiàn)慢性炎癥、病情穩(wěn)定。與之相比，膠原誘導模型更為嚴重，佐劑誘導模型有一定自限性[13]。而且，該模型小鼠是非免疫依賴型的，與重組活化基因（RAG）敲除小鼠（無T細胞、B細胞）雜交后，仍可表現(xiàn)侵蝕性關節(jié)炎，證明該病程非免疫依賴性，有利于研究RA除自身免疫性疾病以外的分子機制。該模型小鼠與易發(fā)關節(jié)炎的DBA/1雜交后，關節(jié)炎發(fā)病更早，程度更重，說明致敏基因DBA/1與TNF-α聯(lián)合作用可加重RA。

4 TNF-Tg小鼠在RA研究中的應用

盡管TNF-α的RA的發(fā)病中十分重要，在TNF-α缺失的情況下，破骨細胞生成、侵蝕性關節(jié)炎及骨溶解仍可發(fā)生。敲除TNF-α或TNFR1后，小鼠仍可出現(xiàn)膠原誘導型關節(jié)炎（Collagen-Induced Arthritis，CIA），但發(fā)生率降低。因此，TNF-α極有可能在RA的某個階段發(fā)揮作用。臨床上30%的患者應用抗TNF-α療法無效，亦證明了這一猜測。TNF-Tg小鼠為研究RA的病理分期提供了良好的模型。

TNF-Tg小鼠為研究TNF-α與其他炎性因子的上下游關系提供了依據(jù)。IL-1可以促進基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）的產(chǎn)生，促進軟骨的降解及骨吸收。用IL-1受體阻斷劑治療該品系小鼠，可抑制關節(jié)炎癥的進展，提示IL-1可能是TNF-α的下游因子。而且，循環(huán)系統(tǒng)中的人TNF-α減少，證明阻斷IL-1會對TNF-α產(chǎn)生負反饋調節(jié)[14]。IL-6升高在RA中會導致炎性細胞的浸潤、滑膜增生以及破骨細胞的活化。TNF-Tg小鼠血清IL-6水平升高，但與IL-6基因沉默的小鼠雜交，對病程進展無明顯影響，避免了病理分子機制研究的混雜性[15]。與之相比，CIA模型對IL-6呈依賴性，敲除IL-6或IL-1后，CIA模型關節(jié)炎癥可減輕或完全抑制。在關節(jié)炎中，對組織起直接破壞作用的是MMP，其中MMP-1、3、9、13在RA患者的滑膜、滑液及血清中高表達，抗TNF-α治療可下調其水平，證明TNF-α會促進MMPs表達[16]。TNF-Tg小鼠關節(jié)中MMP-3、 9、13是高表達的，TMP治療可緩解骨破壞。

RANKL/RANK信號通路骨吸收過程中起著重要作用，骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）治療有效，提示針對該通路治療骨侵蝕意義重大。肌生成抑制蛋白（Myostatin）在該模型小鼠中高表達，敲除Myostatin或使用單克隆抗體治療后，小鼠的骨破壞得到緩解，提示TNF-α可能通過高表達Myostatin激活RANKL/RANK信號通路實現(xiàn)骨破壞[17]。

TNF-Tg小鼠滑膜有明顯的血管新生，這與RA患者的臨床表現(xiàn)一致?？寡苄律幬飪?nèi)皮抑素治療轉基因小鼠有效[18]，提示了血管增生在TNF-α介導的關節(jié)炎中的重要作用。

淋巴管的生成及功能在RA中的作用越來越受到重視。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）可通過促進淋巴回流功能減輕關節(jié)炎癥[19]。研究表明，TNF-Tg模型小鼠關節(jié)中的前體破骨細胞通過NF-κB通路VEGF的表達量增高，促進淋巴管生成；CIA模型小鼠也觀察到相同的改變[20]。該模型炎癥發(fā)病前，腘窩淋巴結腫大，腘窩淋巴結、髂淋巴結的萎縮可作為關節(jié)炎發(fā)病的標志，并進一步探討了其機制可能與B細胞的遷移有關[21,22]。獨活寄生湯[23]、阿魏酸[24]可通過促進淋巴管回流功能起到治療該小鼠模型關節(jié)炎的作用。淋巴管功能的改變已得到臨床試驗的驗證，有可能成為評價RA發(fā)病的新指標[25]。

在診療技術方面，Micro-CT及增強對比磁共振技術對關節(jié)滑膜體積、淋巴結體積[18]、多普勒超聲可有效檢測該模型小鼠的關節(jié)體積及多普勒信號[26,27]，拓展了RA的早期診斷技術范圍。

該模型小鼠用來證明TNF-α在壓迫性骨髓水腫的發(fā)病過程中起到重要作用，可通過生物力學的改變緩解；單純抗TNF-α治療無效[28]。5月齡的TNF-Tg小鼠因為骨破壞嚴重，作為繼發(fā)性骨質疏松的模型，也被用來進行拉曼光譜學[29]的測量，實驗證明，該模型小鼠股骨斷裂載荷及斷裂韌性降低，可能通過泛素連接酶Smurf1介導了骨丟失[30]。

5 總結與展望

TNF-Tg小鼠模型表型穩(wěn)定，存活周期相對較長，不需借助藥物誘導，是一種有效的工具，在類風濕性關節(jié)炎的病理機制、分期分型等研究中具有重要的意義，有利于藥物的開發(fā)及診療技術的改進[31]，值得推廣研究。但是，作為一種轉基因小鼠模型，它也有自身的局限性，存在不能完全復制疾病的病理狀態(tài)、存在其他生理缺陷、動物繁殖數(shù)量有限等多種問題，但這并不能掩蓋它的應用價值。鑒于TNF-α在多種疾病中的重要作用，該模型小鼠也將應用到與TNF-α有關的病理機制的研究中，有利于探討多種疾病的相同分子機制，可拓展藥物的治療范圍及中醫(yī)學“異病同治”理論的研究。TNF-Tg小鼠淋巴管回流功能、淋巴管內(nèi)壓下降，亦可成為研究淋巴管結構與功能的工具。

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A Research Progress on the Rheumatoid Arthritis Model Using TNF Transgenic Mouse

Wang Tengteng1,2, Xu Hao1,2, Wang Yongjun1,2, Shi Qi1,2, Liang Qianqian1,2
(1. Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2. Institute of Spine Disease, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 3. School of Rehabilitation Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China)

Rheumatoid arthritis (RA) was recognized as a chronic and autoimmune disease. The overexpression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) was of great significance in the pathogenesis of RA and mediated the levels of various inflammatory factors. At present, anti-TNF agents were widely used for the treatment of RA in clinic. The genetically modified mice, overexpressing human TNF-α, could appear pathological manifestations being similar to RA with slow onset, high incidence rate and stable occurrence. Therefore, TNF transgenic (TNFTg) mouse model was significant in the study, generally applied to the curative and mechanism researches of RA, especially some remarkable and fruitful studies over lymphatic vessels. In this study, we summarized the pathophysiological characteristics of the mouse model based on the current research status.

Tumor necrosis factor alpha, transgenic mice, rheumatoid arthritis, lymph

10.11842/wst.2016.11.006

R274

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-04

修回日期：2016-11-20

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81330085）：痰瘀型類風濕性關節(jié)炎與淋巴關系的基礎研究，負責人：施杞；國家自然科學基金委重大國際合作項目（81220108027）：益氣祛濕法調控淋巴系統(tǒng)對炎癥性關節(jié)炎的影響，負責人：王擁軍；教育部高等學校全國優(yōu)秀博士學位論文作者專項資金資助項目（201276）：負責人：梁倩倩；上海市龍華醫(yī)院龍醫(yī)創(chuàng)新團隊（LYCX-01）：祛瘀化瘀防治頸痛和炎性關節(jié)炎的基礎研究，負責人：梁倩倩；上海市衛(wèi)計委中醫(yī)藥三年行動計劃項目（ZY3-CCCX-2-1002）：國家中醫(yī)臨床研究基地建設項目，負責人：崔學軍；筋骨理論與治法教育部重點實驗室，負責人：王擁軍；上海市長寧區(qū)衛(wèi)生與計劃生育委員會“光華卓越PI工程”項目（2016-01），負責人：施杞。

＊＊ 通訊作者：梁倩倩，副研究員，碩士生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療關節(jié)炎癥性疾病的療效及機制研究。