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        前交叉韌帶損傷后膝關(guān)節(jié)腔uPA含量變化及意義

        2016-04-05 06:49:00梁曉松羅永忠姜曉玲
        實(shí)用醫(yī)藥雜志 2016年8期
        關(guān)鍵詞:滑膜陽性細(xì)胞韌帶

        吳 波,梁曉松,羅永忠,姜曉玲,孫 磊

        基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

        前交叉韌帶損傷后膝關(guān)節(jié)腔uPA含量變化及意義

        吳 波,梁曉松,羅永忠,姜曉玲,孫 磊*

        目的 探討前交叉韌帶損傷后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)u-PA變化情況及意義。方法40只新西蘭兔一期建立單側(cè)前交叉韌帶損傷模型。損傷術(shù)后2周、3周和4周時(shí)采用ELISA方法檢測膝關(guān)節(jié)液中u-PA含量變化。損傷術(shù)后3周時(shí)采用HE染色和免疫組織化學(xué)檢測關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織病理變化和u-PA表達(dá)情況。結(jié)果前交叉韌帶損傷后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)u-PA生成增加,術(shù)后3周時(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)u-PA含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。術(shù)后3周時(shí)組織學(xué)檢測顯示滑膜組織病理變化明顯,滑膜組織內(nèi)u-PA廣泛表達(dá)、陽性細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.01)。結(jié)論前交叉韌帶損傷后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)u-PA含量增加,可能與滑膜組織病理改變有關(guān)。

        前交叉韌帶損傷;尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA);滑膜;兔

        前交叉韌帶損傷 (anterior cruciate ligament,ACL)是常見的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷,損傷后韌帶通常不能自行愈合,但其具體機(jī)制尚不清楚[1]。近年來,隨著研究深入人們逐漸認(rèn)識到除了力學(xué)因素以外,韌帶損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)生物學(xué)微環(huán)境同時(shí)發(fā)生變化,并對韌帶損傷愈合產(chǎn)生重要影響。Murray等[2]觀察到ACL損傷后缺損部位始終未見修復(fù)組織充填,指出這可能與損傷后關(guān)節(jié)腔微環(huán)境變化有關(guān)。尿激酶型纖溶酶原激活物 (urokinase-type plasminogen activator,u-PA)是對纖維蛋白組織形成起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,同時(shí)還與炎癥反應(yīng)、基質(zhì)降解等多種病理過程有關(guān)[3]。目前,人們對ACL損傷后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)u-PA的變化尚不清楚,本文擬通過動物實(shí)驗(yàn)初步探討ACL損傷后u-PA的變化及其意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料 兔u-PA ELISA試劑盒(上海朗頓),u-PA一抗 (武漢博士德),自動酶標(biāo)分析儀 (美國BioRAD),切片機(jī)(德國Leica),顯微鏡系統(tǒng)(日本Olympus),IPP醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) (美國 Media Cybernetics)等。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 動物分組及手術(shù) 新西蘭大白兔40只,體質(zhì)量(3.0±0.2)kg,雌雄各半,山東魯抗提供。取36只為實(shí)驗(yàn)對象,接受ACL手術(shù)處理。研究對象按時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為三組,即2周、3周及4周組,每組各12只。另外4只為假手術(shù)組作為對照。實(shí)驗(yàn)組對象均接受單側(cè)ACL橫斷處理。麻醉起效后,消毒鋪單,做膝前正中切口,切開內(nèi)側(cè)支持帶,脫位髕骨,顯露關(guān)節(jié)腔,在ACL實(shí)質(zhì)部將其完全橫斷并做2 mm缺損,沖洗關(guān)節(jié)腔,逐層縫合,關(guān)閉切口。術(shù)后常規(guī)預(yù)防感染,患肢不固定,分籠飼養(yǎng),正常飲食,自由活動,觀察進(jìn)食、活動及切口愈合情況。假手術(shù)組僅行關(guān)節(jié)切開術(shù)。

        1.2.2 關(guān)節(jié)液u-PA含量檢測 分別于ACL損傷術(shù)后2周、3周和4周時(shí),取相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組對象的關(guān)節(jié)液進(jìn)行檢測,并取假手術(shù)組關(guān)節(jié)液作為對照。采用ELISA試劑盒檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組關(guān)節(jié)液內(nèi)u-PA含量變化情況。

        1.2.3 組織形態(tài)學(xué)檢測 ACL損傷術(shù)后3周時(shí),處死實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組對象取滑膜組織進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)檢測,觀察滑膜組織病理學(xué)變化和u-PA表達(dá)情況。每張切片取5個(gè)高倍視野(10× 40)觀察計(jì)數(shù),比較u-PA陽性細(xì)胞數(shù)量變化情況。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過IPP醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)進(jìn)行檢測,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示。采用方差分析比較各組之間關(guān)節(jié)液u-PA含量差異,采用t檢驗(yàn)比較滑膜組織內(nèi)u-PA陽性細(xì)胞數(shù)量變化情況,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同組別之間關(guān)節(jié)液u-PA含量變化情況采用ELISA方法檢測ACL損傷術(shù)后2周、3周、4周組及假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)對象關(guān)節(jié)液u-PA水平 (表1)。研究結(jié)果顯示,各組對象之間關(guān)節(jié)液內(nèi)u-PA水平差異明顯(P<0.01)。尤其是,在ACL損傷后3周時(shí)關(guān)節(jié)液中u-PA水平明顯高于假手術(shù)組 (P<0.05)。

        表1 ACL損傷后不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)腔u-PA水平變化()

        組別 n u-P A水平(n g / m l)2周組 1 2 1 4 1 5.2 9 ± 2 3 9.0 6 3周組 1 2 1 7 3 4.7 6 ± 2 4 2.9 5 4周組 1 2 1 5 0 5.8 6 ± 1 6 1.5 5假手術(shù)組 4 1 4 6 5.1 7 ± 2 1 4.1 1

        2.2 病理學(xué)檢測 ACL損傷后3周時(shí),HE染色結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜大量增生,滑膜組織明顯增厚,其內(nèi)有大量細(xì)胞增殖和血管形成。假手術(shù)組滑膜菲薄,未見炎性細(xì)胞浸潤及血管增生。研究結(jié)果提示ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織出現(xiàn)炎性增生的病理變化。

        2.3 滑膜組織u-PA表達(dá)情況 ACL損傷后3周時(shí),研究采用免疫組化檢測滑膜組織內(nèi)u-PA陽性表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示,損傷后增生滑膜組織內(nèi)可見u-PA廣泛表達(dá),大量陽性細(xì)胞聚集。相反地,假手術(shù)組滑膜內(nèi)u-PA呈低水平表達(dá),陽性細(xì)胞稀少。實(shí)驗(yàn)組滑膜組織內(nèi)u-PA陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增高 (37.5±6.8/HPF v.s 4.2±1.9/HPF,P<0.01)(圖1)。研究表明,ACL損傷后病理狀態(tài)下滑膜組織內(nèi)u-PA表達(dá)水平明顯增高。

        3 討論

        目前臨床上通常采用韌帶重建方法治療ACL損傷,但是仍然存在著腱骨愈合、止點(diǎn)重塑、本體感覺恢復(fù)等問題尚未徹底解決。因此,深入研究ACL損傷愈合機(jī)制,對進(jìn)一步提高ACL損傷治療效果有著重要意義。早期有研究發(fā)現(xiàn)ACL損傷后韌帶組織也表現(xiàn)出損傷修復(fù)變化,經(jīng)歷炎癥反應(yīng)、細(xì)胞長入,滑膜增生、血管形成及細(xì)胞增殖、韌帶塑形等過程。然而,損傷韌帶最終僅形成被滑膜組織包裹的殘跡,而未能形成有效的組織連接[4]。內(nèi)側(cè)副韌帶損傷后韌帶通常能夠較好地自我愈合,在其損傷修復(fù)區(qū)域可見纖維蛋白組織形成。這種重要的修復(fù)組織充填可以為后續(xù)修復(fù)細(xì)胞長入、增殖提供必要場所。然而,即使是在力學(xué)穩(wěn)定的ACL中央型損傷模型中,韌帶損傷部位也未能形成纖維組織充填[2,5]。由此可見,除了力學(xué)穩(wěn)定性之外,ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)生物學(xué)微環(huán)境也發(fā)生改變,并對韌帶損傷修復(fù)產(chǎn)生重要影響。

        纖維蛋白組織形成是一種普遍的病理現(xiàn)象,廣泛存在于血液凝結(jié)、血栓形成、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)等多種病理變化過程中。皮膚、肝和骨組織等組織損傷修復(fù)區(qū)域均可見纖維蛋白組織形成[6]。纖維蛋白形成和降解之間存在著動態(tài)平衡,不同病理狀態(tài)下這種平衡可能發(fā)生改變。纖維蛋白組織降解受到纖維蛋白溶酶的調(diào)控,纖維蛋白溶酶原在纖維蛋白溶酶原激活物調(diào)控下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻富钚缘睦w維蛋白溶酶。u-PA是一種絲氨酸蛋白酶,能夠水解纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白溶酶。u-PA不僅在纖維蛋白溶解過程中起著關(guān)鍵作用,還在炎癥反應(yīng)、基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移、組織修復(fù)及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種病理過程中起著重要作用[7,8]。

        Murray等[2]曾指出膝關(guān)節(jié)液中纖溶酶可能影響了韌帶損傷區(qū)域內(nèi)纖維蛋白組織的形成。本文研究結(jié)果顯示ACL損傷后關(guān)節(jié)液內(nèi)u-PA含量水平明顯增高,關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織大量增生、細(xì)胞增多,并且高水平表達(dá)u-PA。研究結(jié)果表明,ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)生物學(xué)微環(huán)境發(fā)生重要變化,u-PA可能對韌帶損傷修復(fù)過程產(chǎn)生不利影響。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)u-PA與多種關(guān)節(jié)疾病密切相關(guān)。王維山等[9]研究發(fā)現(xiàn)膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿和關(guān)節(jié)液中u-PA含量水平明顯高于正常體檢者。另外有研究顯示炎性因子IL-1β能夠通過JNK-Akt-F-κB a信號通路刺激人軟骨細(xì)胞u-PA表達(dá)增強(qiáng),可能與膝骨性關(guān)節(jié)炎病理改變有關(guān)[10]。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥可通過抑制損傷軟骨u-PA形成、減少滑膜反應(yīng),進(jìn)而對骨性關(guān)節(jié)炎起保護(hù)作用。

        上述相關(guān)研究表明在疾病、損傷等病理狀態(tài)下膝關(guān)節(jié)腔微環(huán)境內(nèi)u-PA形成增加,與組織損傷修復(fù)、關(guān)節(jié)破壞、疾病發(fā)展等密切相關(guān)。本文研究表明ACL損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)生物學(xué)微環(huán)境發(fā)生改變,關(guān)節(jié)內(nèi)u-PA含量水平增高,可能與關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織增生有關(guān)。本項(xiàng)目研究對進(jìn)一步加深A(yù)CL損傷修復(fù)過程認(rèn)識,提高其治療效果有著重要意義。

        [1]Murray MM,F(xiàn)leming BC.Biology of anterior cruciate ligament injury and repair:Kappa delta ann doner vaughn award paper 2013[J].J Orthop Res,2013,31(14):1501-1506.

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        [2016-02-16收稿,2016-03-14修回] [本文編輯:韓仲琪]

        The levels change and its significance of urokinase-type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury

        WU Bo①,LIANG Xiao-song,LUO Yong-zhong,etal.Department of Orthopaedics,the 88th Hospital of Chinese PLA,Taian,Shandong 271000,China

        Objective To investigate the levels change and its significance of urokinase-type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury.MethodsForty New Zealand rabbits were employed in this study and the transection of anterior cruciate ligament was created in the unilateral knee.The concentrations of urokinase-type plasminogen activator in joint fluid were detected by ELISA postoperatively at 2,3,and 4 weeks after injury.At 3 weeks after injury the pathological change and expression of urokinase-type plasminogen activator were further evaluated in the synovium.ResultsThe level of urokinase-type plasminogen activator in joint fluid had dramatically changed.The levels of urokinase-type plasminogen activator were significantly elevated at 3 weeks after injury than that of sham operation group(P<0.05).At 3 weeks after injury the pathological changes were proven significant in the synovium.Moreover,in the synovium the expression of urokinase-type plasminogen activator was elevated and the number of the positive cells markedly increased(P<0.01).ConclusionThe levels of urokinase-type plasminogen activator in the knee joint are significantly increased which may be related to the pathological changes of the synovium.

        Anterior cruciate ligament injury;Urokinase-type plasminogen activator(u-PA);Synovium;Rabbit

        R686:R684

        A

        10.14172/j.issn1671-4008.2016.08.020

        山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014HQ010;ZR2013 HM010)

        271000山東泰安,解放軍88醫(yī)院全軍骨科中心 (吳波,梁曉松,羅永忠,孫磊),病理科(姜曉玲)

        孫磊,Email:sl88h@163.com

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