郭德民

(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱 150036)

豬瘟疫苗生產(chǎn)中存在的問題及工藝改進

郭德民

(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱 150036)

瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)雖然僅有一種血清型，但是其有毒力的強弱之分，如果豬的本身有疾病，則免疫就會失敗而達不到免疫的效果。本次研究主要通過對豬瘟疫苗生產(chǎn)中的問題進行探討，進一步的對豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝進行研究。

豬瘟疫苗；豬瘟病毒；生產(chǎn)工藝

當前三種最為常見的豬瘟疫苗是豬瘟乳兔組織活疫苗（組織苗）、豬瘟細胞活疫苗（細胞苗）、豬瘟脾淋活疫苗（組織苗）。給健康的豬接種組織苗同細胞苗的效果相同，如果是緊急接種則組織苗比細胞苗好，主要原因是在組織苗當中的部分組織蛋白，尤其是脾淋苗當中的淋巴因子是免疫促進劑。必須要注意的就是在超前免疫當中不能使用組織苗，因為組織苗對還沒有吃到初乳的豬仔能夠引發(fā)較為嚴重的免疫應(yīng)激反應(yīng)。

1 豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝當中存在的問題

1.1 豬瘟病毒培養(yǎng)難

在滴度較低的豬瘟細胞毒轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)過程當中，病毒的粒子在細胞當中成熟之后就會釋放到營養(yǎng)液當中，進而致使部分的病毒粒子活性喪失。生產(chǎn)過程當中，不容易對打次收獲病毒的方式進行控制，總的毒價在多次收獲病毒之后降低；體外進行培養(yǎng)的細胞當中，CSFV保持較低水平的增殖，產(chǎn)生出的子代病毒有較低的滴度。因此進而配苗抗原就難達到均以穩(wěn)定質(zhì)量標準。

1.2 豬瘟病毒抗原的檢測方法落后

當前進行增殖的CSFV包括豬腎細胞、羊睪丸細胞還有豬睪丸細胞，一般性的細胞培養(yǎng)過程不會發(fā)生細胞的病變，使用兔體的反應(yīng)量對抗原進行間接性的檢測，對抗原進行定量較為困難，對目前疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量影響嚴重。

1.3 疫苗的效力標準過低

C柱疫苗免疫在歐洲的藥典當中規(guī)定進行肌肉注射的劑量是100PD。而在我國進行豬瘟苗免疫所規(guī)定的標準劑量是37PD。與國際標準相比，我國的標準劑量過低。

1.4 生產(chǎn)方法較為落后

抗原所存在的生物安全性隱患采用兔的淋巴結(jié)、脾臟以及乳兔的組織來進行生產(chǎn)。牛病毒性腹瀉病毒污染嚴重威脅著牛睪丸細胞苗；兔源影響兔脾淋苗，有著質(zhì)量不穩(wěn)定問題。疫苗的效力檢驗以及抗原質(zhì)量的控制均使用較為落后的兔體致熱法，檢驗時需要較大量的兔子，質(zhì)量指標穩(wěn)定較難。接種之后兔子能發(fā)產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)與兔子對病毒的敏感性以及外界因素有關(guān)。顯然，如果在接種過程當中兔子感染了別的病原，則不能說明發(fā)熱反應(yīng)是因為接種了豬瘟病毒引起的。另外，脾淋苗生產(chǎn)的成本較高，許多廠家是否采用未曾接種的兔子來做脾淋苗值得懷疑。兔子的大小、品種以及健康狀況都會對豬瘟病毒在體內(nèi)的增殖情況產(chǎn)生影響，因此組織苗生產(chǎn)的供體動物嚴格需要同一品種、統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.5 生產(chǎn)工藝全過程未能達到GMP標準

雖然豬瘟疫苗抗原的部分下游工藝，包括配制、凍干等都在GMP的環(huán)境當中進行，但是對兔子進行飼養(yǎng)、接種以及解剖工作要在非GMP的環(huán)境當中進行。并且在進行配苗的工序當中不需要在連續(xù)性的封閉系統(tǒng)當中進行，需要進行獨立性、分散性的操作，進而使得疫苗的抗原完全暴露或者半暴露在外界環(huán)境當中，增加了污染的危險性。

2 豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝的改進方向

2.1 豬瘟疫苗生產(chǎn)抗原定量及效力檢驗方法的改進

有的學(xué)者采用進行了原核表達的豬瘟疫苗E2蛋白抗原以及BAIB/c小鼠，通過對CSFV進行單克隆進而建立AC-ELISA的方法，對豬瘟疫苗的臨床組織樣品、細胞的培養(yǎng)物以及攻毒致死的豬病料進行檢測，研究顯示此類方法重復(fù)性、特異性以及敏感性都較好。此方法可以在較短時間內(nèi)迅速準確的將大批量的樣品中的CSFV檢測出來，比病毒分離法以及免疫熒光法優(yōu)異，其特點是半自動化、自動顯示結(jié)果，更加適合在研發(fā)機構(gòu)以及生產(chǎn)機構(gòu)應(yīng)用。有的學(xué)者進行熒光定量PCR（FQ—PCR）檢測時將構(gòu)建的質(zhì)粒做為了標準，此類方法能夠在臨床診斷上應(yīng)用。當前，在國內(nèi)外已經(jīng)建立了應(yīng)用于豬瘟病毒抗體以及抗原檢測的ELISA技術(shù)，多數(shù)為抗體檢測技術(shù)，大多數(shù)在疫苗免疫效果評估以及流行病學(xué)黨章應(yīng)用，在疫苗生產(chǎn)抗原的質(zhì)量控制當中還未應(yīng)用。在包被抗體以及檢測抗體的建立當中使用單克隆抗體作為熒光抗體的方法或者是抗原捕捉ELISA，其特點是特異性高，但是敏感性低；使用多克隆抗體敏感性高，特異性低。有的學(xué)者采用噬菌體肽庫，在組織樣品當中的豬瘟病毒抗原的檢測以及診斷當中，設(shè)立依賴噬菌體擬位競爭性的ELISA方法。競爭性的ELISA優(yōu)點是高敏感性、高特異性，此類方法在毒素蛋白以及抗原的檢測當中已經(jīng)得到應(yīng)用?？乖臏蚀_定量方法可以讓配苗當中的抗原和成品的疫苗有效的抗原量化具有更高的準確性和科學(xué)性，能夠使得豬瘟疫苗的效力變得均一穩(wěn)定，免疫劑量的準確可以讓免疫劑量不足的問題得到避免，同時也可以讓因為免疫劑量過大導(dǎo)致免疫抑制的現(xiàn)象得到避免。

2.2 病毒培養(yǎng)方式的改進及抗原的濃縮純化

采用傳代細胞方式對病毒進行生產(chǎn)可以讓動物組織以及原代細胞帶來的安全風(fēng)險降到最低甚至可以得到避免，并且含有病毒的培養(yǎng)液當中的病毒含量較高，批次之間的差異較小，穩(wěn)定性較好。采用ST細胞生物反應(yīng)器微載體生產(chǎn)豬瘟病毒技術(shù)，能夠有效的提高CSFV滴度。此類微載體屬于一種多孔微珠，可以在懸浮細胞的培養(yǎng)物當中添加，細胞就可以馬上在微載體上粘附并生長。因為培養(yǎng)基用量的減少以及細胞培養(yǎng)量的擴大，CSFV滴度得到了顯著提高，而且此類微載體通過處理之后可以循環(huán)使用。采用生物反應(yīng)器自動控制參數(shù)，可以讓產(chǎn)品質(zhì)量更加的穩(wěn)定、生產(chǎn)工藝更加的先進。當前我國關(guān)于豬瘟抗原濃縮純化方面的研究較少，可以采用離心和超濾的方法來進行細胞培養(yǎng)抗原的濃縮純化。有的研究對豬瘟病毒抗原進行純化采用反向親和層析法，將抗原當中殘存的牛睪丸細胞培養(yǎng)物去除，總的蛋白去除率可以高達76.9%；采用進行純化前以及純化后的抗原對豬瘟免疫血清進行檢測，豬瘟免疫血清當中的非相關(guān)性抗體反應(yīng)可以通過純化抗原去除，讓豬瘟免疫抗體檢測的特異性得到有效確保。

[1] 朱良全，彭雋，王棟，等.豬瘟疫苗研究進展及我國傳統(tǒng)疫苗的研究現(xiàn)狀[J].中國獸藥雜志，2005，39（2）：33-37.