邵圣娟， 李 曉， 衛(wèi)靜莉

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西太原030008）

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超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮

邵圣娟， 李 曉， 衛(wèi)靜莉

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西太原030008）

摘要：目的 采用超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮，并優(yōu)化工藝條件。方法 以馬尾松花粉中的總黃酮量為指標(biāo)，通過考察纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素的影響，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果 最優(yōu)提取工藝參數(shù)組合為纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％，溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)60％，液固比25∶1，超聲時(shí)間30 min，總黃酮含有量12.02 mg/g。結(jié)論 該方法不僅提取時(shí)間短，提取條件溫和，溶劑用量少，提取率高，提取成本低，而且減少了有機(jī)溶劑帶來的環(huán)境污染。

關(guān)鍵詞：馬尾松花粉；總黃酮；超聲提??；纖維素酶解

黃酮類化合物具有降血脂、降血糖、預(yù)防心血管疾病等作用，同時(shí)它還是一種天然的抗氧化劑，具有清除氧自由基、抗氧化、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的生理活性［1］，廣泛存在于自然界的某些植物中?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，每1 g松花粉中含有17.6 mg黃酮［2］，尤以油松、馬尾松花粉中黃酮類含有量較高。

目前，松花粉中黃酮類化合物常見的提取方法為有機(jī)溶劑浸提。李雪梅［2］等通過比較不同溶劑對(duì)松花粉中總黃酮的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙醇為最佳溶劑，并考察了影響總黃酮提取的因素。隨著新技術(shù)在天然藥物提取中的應(yīng)用與發(fā)展，對(duì)于該類物質(zhì)的提取逐漸發(fā)展為超聲波輔助提取法［3-4］、微波輔助提取法［5-6］、超臨界萃取法［7］，而對(duì)于被細(xì)胞壁包裹的某些植物類黃酮物質(zhì)，可以采用酶解法［8-9］。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助纖維素酶解法，以乙醇水溶液為溶劑，對(duì)馬尾松花粉總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行研究，考察纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度等單因素的影響，正交試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳提取工藝參數(shù)，從而為其作為營養(yǎng)保健品、化妝品的開發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BL3-120A數(shù)控超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL20-B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-1恒溫水浴鍋（金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠）；FA2104電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 天然未破壁云南馬尾松Pinusmassoniana Lamb.花粉（40目）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98％，中國藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（活性單位＞20 U/mg，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司）。無水乙醇、NaOH、NaNO2、A1（NO3）3均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 馬尾松花粉總黃酮的測(cè)定方法

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于105℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取10 mg，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，60％ （V/V）乙醇溶解，稀釋定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，轉(zhuǎn)移至6支25 mL量瓶中，依次加入5％ NaNO2溶液1 m L，混勻，靜置6 min；10％ A1（NO3）3溶液1 mL，混勻，靜置6 min；10％NaOH溶液10 mL，去離子水定容至刻度，靜置15 min。以去離子水為空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度溶液的吸光度［10］，對(duì)不同蘆丁質(zhì)量濃度（C）和對(duì)應(yīng)吸光度（A）作圖，線性回歸得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

其中，Y為馬尾松花粉總黃酮含有量（mg/g）；C為粗提液的質(zhì)量濃度（mg/mL）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出，M是松花粉的質(zhì)量（g）。

2.2 單因素提取試驗(yàn) 以馬尾松花粉中總黃酮的含有量（Y）為指標(biāo)，分別考察纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)馬尾松花粉中總黃酮提取效果的影響。以纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為例，具體實(shí)驗(yàn)過程如下。

取松花粉3 g，以15∶1的液固比例加入到60％乙醇水溶液中，HAc-NaAc緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為5，分別加入占松花粉質(zhì)量0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的纖維素酶溶解，將燒瓶置于50℃水浴鍋中，恒溫水浴加熱90 min，再超聲提取（40 W、45℃）20 min后，沸水浴滅活5 min，得到粗提取液。真空抽濾，濾液離心，60％乙醇水溶液定容至50 mL量瓶中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測(cè)定各粗提取液的吸光度（A）。然后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出對(duì)應(yīng)的總黃酮濃度（C），進(jìn)而得出不同纖維素酶質(zhì)量濃度下的總黃酮含有量（Y）。

2.3 正交試驗(yàn) 在“2.2”項(xiàng)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合適的正交試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以此確定最優(yōu)的提取條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)不同蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL，C）和對(duì)應(yīng)吸光度值（A）作圖，線性回歸得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C=0.053 4A+0.001 3，r2=0.999 1，在0.000 0～0.020 0 mg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 單因素提取試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液，在超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時(shí)間20 min的條件下，分別考察0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％纖維素酶質(zhì)量濃度對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

由圖可知，隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，馬尾松花粉中總黃酮含有量先升后降，當(dāng)纖維素酶用量占松花粉質(zhì)量的0.2％時(shí)，酶解反應(yīng)效率和馬尾松花粉中總黃酮提取率最高；當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，反應(yīng)底物濃度相對(duì)較大，此時(shí)兩者的結(jié)合未達(dá)到飽和，酶解反應(yīng)速度和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，故增大纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶解反應(yīng)速度也隨之增大；當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，直至反應(yīng)底物被酶完全飽和時(shí)，酶解反應(yīng)效率達(dá)到最高；若繼續(xù)增大，酶解反應(yīng)速度不再增加，甚至?xí)档停赡苁怯捎诿阜磻?yīng)中間絡(luò)合物的抑制作用。因此，適宜的纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％～0.3％。

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％、液固比為15∶1的乙醇水溶液，設(shè)定超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時(shí)間20 min，分別考察30％、40％、50％、60％、70％乙醇對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響

由圖可知，馬尾松花粉中總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)達(dá)到一定值后，提取率開始降低，表明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，對(duì)黃酮類有效成分的溶解作用較??；隨著其增大，傳質(zhì)推動(dòng)力增加，其溶解作用將增大；但若乙醇體積分?jǐn)?shù)太大，相應(yīng)的醇溶性雜質(zhì)也會(huì)增加，而且會(huì)對(duì)纖維素酶的活性產(chǎn)生抑制作用，從而降低了提取效果。因此，選擇乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為40％～60％較為合適。

3.2.3 液固比對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設(shè)定超聲功率40 W、溫度45℃、超聲時(shí)間20 min，分別考察10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1液固比對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　液固比對(duì)總黃酮提取的影響

由圖可知，馬尾松花粉總黃酮提取率隨液固比的增加而增大，這是因?yàn)槿軇┝吭酱?，有效成分從植物組織內(nèi)溶解到溶劑中的濃度差就越大，越有利于有效成分的擴(kuò)散傳質(zhì)。但溶劑用量達(dá)到一定程度后，提取率增加緩慢?？紤]到經(jīng)濟(jì)性及實(shí)驗(yàn)后處理過程，選擇液固比為15∶1～25∶1較為合理。

3.2.4 超聲溫度對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設(shè)定超聲功率40 W，超聲時(shí)間20 min，分別測(cè)定40、45、50、55、60℃超聲溫度下對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　超聲溫度對(duì)總黃酮提取的影響

由圖可知，超聲溫度對(duì)馬尾松花粉中總黃酮提取的影響不大，不同溫度條件下總黃酮的提取率接近，表明纖維素酶在40～60℃范圍內(nèi)均有較好的酶解效果。因此，正交試驗(yàn)將超聲溫度的影響因素排除在外，僅設(shè)定為50℃。

3.2.5 超聲時(shí)間對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響 采用液固比為15∶1的60％乙醇水溶液和0.2％纖維素酶，設(shè)定超聲功率為40 W，超聲溫度為50℃，分別測(cè)定0、10、20、30、40 min超聲時(shí)間對(duì)馬尾松花粉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

由圖可知，在一定超聲時(shí)間內(nèi)，超聲波輔助提取有效提高了松花粉總黃酮的提取率。超聲波可以有效破壞馬尾松花粉的細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)更多物質(zhì)溶出，使總黃酮提取率增加。但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，較多的雜質(zhì)也相應(yīng)溶出，導(dǎo)致黃酮類有效成分相對(duì)減少，也可能由于超聲作用時(shí)間過長(zhǎng)，破壞了纖維素酶的結(jié)構(gòu)，降低了酶的活性，使松花粉中總黃酮提取率又有所降低。因此，選擇超聲作用時(shí)間為20～40 min較為合理。

3.3 正交試驗(yàn) 由“3.2.4”項(xiàng)下結(jié)果可知，超聲溫度對(duì)馬尾松花粉中總黃酮提取率的影響不大，纖維素酶在40～ 60℃范圍內(nèi)均有較好的酶解效果。因此，僅需考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液固比（B）、纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）、超聲時(shí)間（D）4個(gè)因素的交叉影響作用。以單因素提取試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化馬尾松花粉總黃酮的提取工藝條件，見表1。

表1　L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

然后，以馬尾松花粉總黃酮含有量為指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，見表2。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表可知，在超聲波-纖維素酶解法提取馬尾松花粉總黃酮的條件下，各因素對(duì)松花粉總黃酮提取率的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞液固比，可見乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響程度最顯著，而液固比最不顯著，可視為誤差項(xiàng)。此外，方差分析結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)、纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間對(duì)松花粉總黃酮的提取都有顯著的影響（P＜0.05），但其程度存在差異，與極差分析結(jié)果一致。同時(shí)，A3（9.77）、B3（7.98）、C2（8.43）、D2（8.20）均數(shù)最大，得出最優(yōu)提取條件為A3B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60％，液固比25∶1，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20％，超聲時(shí)間30 min。

然后，按“2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)正交試驗(yàn)所得最優(yōu)組合A3B3C2D2進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，該條件下馬尾松花粉總黃酮含有量達(dá)到12.02 mg/g。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助纖維素酶解法提取馬尾松花粉中的總黃酮，通過正交試驗(yàn)考察了各因素對(duì)其影響程度，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最為顯著，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間的增加，總黃酮提取率達(dá)到最大值，最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60％，液固比25∶1，纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20％，超聲時(shí)間30 min，所得馬尾松花粉總黃酮含有量為12.02 mg/g。

總之，纖維素酶解和超聲波協(xié)同作用提取馬尾松花粉中的總黃酮與傳統(tǒng)提取方法相比，提取時(shí)間短，提取條件溫和，溶劑用量少，提取率高，而且在減少提取成本的同時(shí)，也減少了有機(jī)溶劑帶來的環(huán)境污染。

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作者簡(jiǎn)介：邵圣娟（1987—），女，碩士，助教，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取分離。E-mai1：youyou121abc@126.com

基金項(xiàng)目：太原工業(yè)學(xué)院院級(jí)科學(xué)基金（2014LY03）

收稿日期：2015-02-15

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.050

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0204-04