王 超, 王 曉, 張會(huì)欣, 邢邯英, 王 杏, 劉 敏, 張 哲
(1.河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊050051;2.河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室,河北石家莊050035)
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通心絡(luò)膠囊對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變KK/Up j-Ay小鼠血管生成的影響
王 超1, 王 曉1, 張會(huì)欣2*, 邢邯英1, 王 杏1, 劉 敏1, 張 哲1
(1.河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊050051;2.河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室,河北石家莊050035)
摘要:目的 觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變KK/Upj-Ay小鼠血管生成的影響。方法 KK/Upj-Ay小鼠隨機(jī)分為模型組、通心絡(luò)高劑量組、通心絡(luò)中劑量組和通心絡(luò)低劑量組,另設(shè)C57BL/6小鼠為對(duì)照組。灌胃給藥12周,測(cè)定熱痛覺(jué)閾值和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV);放免法測(cè)定血液中內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)含有量;Rea1Time PCR(qPCR)和Western b1ot法測(cè)定坐骨神經(jīng)造血祖細(xì)胞抗原(CD34)、血管性血友病因子(VWF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較,模型組熱痛覺(jué)閾值明顯降低,MNCV明顯減慢(P<0.01);ET和TXA2含有量顯著升高(P<0.01);小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGFmRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,通心絡(luò)組小鼠痛覺(jué)閾值升高,MNCV明顯增快(P<0.05,P<0.01);ET和TXA2含有量明顯降低,PGI2含有量上升(P<0.05,P<0.01);CD34、VWF、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論 通心絡(luò)膠囊可調(diào)節(jié)血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達(dá),改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。
關(guān)鍵詞:通心絡(luò)膠囊;糖尿病周圍神經(jīng)病變;CD34;VWF;VEGF
近年來(lái),盡管糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)在發(fā)病機(jī)制和治療方面取得了很大進(jìn)展,但其機(jī)制仍未闡明,藥物治療也并不十分理想,開(kāi)發(fā)療效確切的新藥仍是DPN研究的重要課題[1]。本實(shí)驗(yàn)采用由人參、水蛭、全蝎等12味中藥材組方的具有通絡(luò)止痛,益氣活血功效的藥物通心絡(luò)膠囊進(jìn)行干預(yù)[2-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn),通心絡(luò)對(duì)于糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的神經(jīng)癥狀和體征有明顯改善作用,能夠顯著提高周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度[4-5],而DPN的發(fā)生發(fā)展與微血管病變、血管生成等血管因素密切相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用DPN小鼠,用通心絡(luò)膠囊加以干預(yù),觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)DPN坐骨神經(jīng)血管生成的影響,為深入了解DPN的作用機(jī)制以及臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)參考。
1.1 動(dòng)物 10只25~30 g的SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠;40 只30~40 g的SPF級(jí)雄性KK/Upj-Ay小鼠。均購(gòu)自于北京華阜康生物公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK-(京)2009-0004。
1.2 藥品與試劑 通心絡(luò)膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)20110501);內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)放免試劑盒購(gòu)自北京東亞免疫技術(shù)研究所;上海生工生物技術(shù)公司合成造血祖細(xì)胞抗原(CD34)、血管性血友病因子(VWF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)引物;CD34、VWF和VEGF一抗由Abcam公司生產(chǎn)。
1.3 儀器 7300熒光定量PCR儀采購(gòu)于ABI公司;凝膠成像分析儀為Biorad公司生產(chǎn);GC-1200 γ全自動(dòng)放免分析儀購(gòu)自中科中佳公司;PowerLab生理記錄儀購(gòu)自AD Instrument公司。
1.4 動(dòng)物分組與給藥 按照空腹血糖值(FBG)把KK/ Upj-Ay小鼠(40只)平均分為模型組,通心絡(luò)高、中、低劑量組,10只C57BL/6小鼠設(shè)為對(duì)照組。連續(xù)12周,通心絡(luò)高、中、低劑量組每日灌胃給予通心絡(luò)膠囊,分別相當(dāng)于4、2、1 g生藥/kg;對(duì)照組與模型組每日根據(jù)小鼠體質(zhì)量,給予相同體積純水[2]。
1.5 熱痛覺(jué)閾值測(cè)定和坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)測(cè)定最后一次給藥結(jié)束后,測(cè)定小鼠熱痛覺(jué)閾值。以小鼠于55℃恒溫?zé)岚鍍x上的舔足反應(yīng)潛伏期作為痛覺(jué)閾值。MNCV在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,連接PowerLab生理記錄儀測(cè)得。于小鼠右側(cè)坐骨切跡,踝部與左足底第2趾間分別插入刺激電極與兩個(gè)記錄電極,每隔1 min記錄一次雙通道復(fù)合動(dòng)作電位,取3次的平均值進(jìn)行計(jì)算[7-9](MNCV=兩對(duì)記錄電極間距離除以兩通道復(fù)合動(dòng)作電位潛伏期之差[10])。
1.6 FBG、ET、TXA2和PGI2含有量測(cè)定 最后一次給藥后,用微量血糖儀測(cè)定小鼠FBG水平;按放免試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定ET、TXA2和PGI2水平。
1.7 熒光定量PCR方法測(cè)定CD34、VWF和VEGFmRNA的表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提取小鼠新鮮坐骨神經(jīng)組織總RNA,參照試劑盒說(shuō)明加樣后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),之后再采用熒光定量qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參Gapdh與目的基因引物設(shè)計(jì)如下。
CD34引物:正向?yàn)?′-GCCTGGAACTAAGTGAAGCAT-3′,反向?yàn)?′-GCCAAGACCATCAGCAAAC-3′,產(chǎn)物片段175 bp。VWF引物:正向?yàn)?′-CCTGGTGGTAGACTTCGGAA-3′,反向?yàn)?′-GCAAACCTGGTCAAGCGT-3′,產(chǎn)物片段108 bp。Vegf引物:正向?yàn)?′-TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC-3′,反向?yàn)?′-TGGAGTATTTCCGTGACCG-3′,產(chǎn)物片段150 bp。內(nèi)參照Gapdh引物:正向?yàn)?′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′,反向?yàn)?′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′,產(chǎn)物片段143 bp。用儀器自帶的分析軟件,將對(duì)照組設(shè)定為1,以相對(duì)定量值RQ作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.8 Western b1ot法檢測(cè)CD34、VWF和VEGF蛋白的表達(dá)
提取小鼠坐骨神經(jīng)總蛋白,進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜,封閉后按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟依次加入CD34、VWF、VEGF和GAPDH的一抗以及二抗,顯影后掃描條帶分析其吸光度值,并以CD34、VWF、VEGF與GAPDH的吸光度比值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[9]。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行ANOVA分析和Dunnett檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù),結(jié)果以±s的形式表示。
2.1 各組小鼠FBG的變化 給藥12周后,各組小鼠FBG均有變化。與對(duì)照組相比,模型組FBG升高明顯(P<0.01);與模型組相比,通心絡(luò)組FBG有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組小鼠FBG的變化(±s,n=10)
表1 各組小鼠FBG的變化(±s,n=10)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01
組別 劑量/ (g.kg-1)FBG/(mmo1.L-1)給藥前 第12周對(duì)照組- 5.33±0.81 5.51±0.88模型組 - 14.83±2.66** 17.54±2.79**通心絡(luò)低劑量組 1 14.72±2.78 16.46±2.44通心絡(luò)中劑量組 2 14.64±2.61 15.84±1.86通心絡(luò)高劑量組4 14.86±2.31 14.97±2.27
2.2 各組小鼠痛覺(jué)閾值及MNCV變化 模型組與對(duì)照組小鼠相比,痛覺(jué)閾值明顯降低,MNCV明顯減慢(P<0.01);與模型組相比,通心絡(luò)中、高劑量組痛覺(jué)閾值明顯上升,MNCV明顯增快(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。
表2 各組小鼠痛覺(jué)閾值及MNCV的變化(±s,n=10)
表2 各組小鼠痛覺(jué)閾值及MNCV的變化(±s,n=10)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01
組別 劑量/ (g.kg-1)痛覺(jué)閾值/ (m.s-1)MNCV/ (m.s-1)對(duì)照組- 16.99±2.00 24.44±0.06模型組 - 8.82±1.22** 5.43±1.01**通心絡(luò)低劑量組 1 9.64±1.50 6.16±1.12通心絡(luò)中劑量組 2 11.50±1.85# 7.82±1.63#通心絡(luò)高劑量組 4 12.63±2.19## 9.54±1.77##
表3 各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化(±s,n=10)
表3 各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化(±s,n=10)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01
組別 劑量/(g.kg-1) ET-1/(pg.L-1) TXA2/(pg.L-1) PGI2/(pg.mL-1)對(duì)照組57.18±10.34 247.16±36.61 88.79±15.69模型組 - 71.06±10.53** 305.22±41.19** 97.10±14.83通心絡(luò)低劑量組 1 66.92±10.94 280.80±43.92 118.03±19.04#通心絡(luò)中劑量組 2 62.86±7.00 278.04±29.08 136.53±23.95##通心絡(luò)高劑量組 4 61.58±7.65# 261.27±30.71## 122.54±17.63 -##
2.3 各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化與對(duì)照組比較,模型組小鼠ET和TXA2含有量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,通心絡(luò)高劑量組ET和TXA2含有量明顯降低,通心絡(luò)組PGI2含有量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表3。
2.4 坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGFmRNA表達(dá)變化 模型
組CD34、VWF、Vegf mRNA表達(dá)明顯比對(duì)照組下調(diào)(P<0.01);通心絡(luò)中、高劑量組CD34、VWF、Vegf mRNA表達(dá)均比模型組顯著上升(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表4。
表4 各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、Vegf m RNA表達(dá)的變化(±s,n=3)
表4 各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、Vegf m RNA表達(dá)的變化(±s,n=3)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01
Vegf對(duì)照組組別 CD34 VWF 0.90±0.09 1.16±0.20 1.15±0.13模型組 0.36±0.06**0.37±0.08** 0.30±0.03**通心絡(luò)低劑量組0.34±0.02 0.49±0.08 0.35±0.04通心絡(luò)中劑量組 0.65±0.06##0.61±0.10# 0.70±0.07##通心絡(luò)高劑量組 0.67±0.06##0.70±0.13## 0.75±0.07##
2.5 坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGF蛋白表達(dá)變化 模型組CD34、VWF、VEGF蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01);與模型組比較,通心絡(luò)組CD34蛋白表達(dá)顯著上升,中、高劑量組VWF、VEGF蛋白表達(dá)也均顯著上升(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表5、圖1。
表5 各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、VEGF的蛋白表達(dá)(±s,n=3)
表5 各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、VEGF的蛋白表達(dá)(±s,n=3)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01
CD34 VWF VEGF對(duì)照組組別0.97±0.13 1.27±0.20 0.79±0.09模型組 0.29±0.03**0.42±0.06** 0.28±0.05**通心絡(luò)低劑量組 0.40±0.06#0.53±0.08 0.36±0.06通心絡(luò)中劑量組 0.45±0.07# 0.68±0.10# 0.53±0.09#通心絡(luò)高劑量組 0.68±0.12# 0.76±0.12# 0.66±0.10##
1.對(duì)照組 2.模型組 3.通心絡(luò)低劑量組 4.通心絡(luò)中劑量組 5.通心絡(luò)高劑量組圖1 各組W estern blot結(jié)果
在本實(shí)驗(yàn)中,我們采用了具有高血糖、高胰島素抵抗特點(diǎn)的自發(fā)性II型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠,該小鼠表現(xiàn)出低的痛覺(jué)閾值及減慢的神經(jīng)傳導(dǎo)速度,可作為DPN動(dòng)物模型[11]。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也觀察到了光鏡電鏡下可見(jiàn)坐骨神經(jīng)毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹,管腔狹窄,表明DPN小鼠存在神經(jīng)內(nèi)膜血管病變[12]。
血管障礙、血流動(dòng)力學(xué)變化及血管活性物質(zhì)減少等是神經(jīng)微血管病變的重要表現(xiàn)。ET是已知的強(qiáng)血管收縮劑,ET大量釋放可通過(guò)影響血流動(dòng)力學(xué)的改變參與微血管病變的發(fā)病機(jī)制[13]。TXA2是一種重要的縮血管物質(zhì),而PGI2是一種重要的抑制血管收縮物質(zhì),兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)最終導(dǎo)致缺血、缺氧性神經(jīng)損害。臨床研究發(fā)現(xiàn),DPN患者給予前列腺素E1治療能顯著改善患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[14]。因TXA2、PGI2非常容易自發(fā)水解成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物:TXB2與6-Keto-PGF1a,所以測(cè)定TXB2、6-K-PGF1a的含有量可以分別反映TXA2和PGI2的含有量[15]。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPN小鼠TXA2/PGI2的平衡被破壞,給予通心絡(luò)膠囊治療后,血液中ET-1水平下降,TXA2代謝物TXB2含有量下降,PGI2代謝物6-K-PGF1 a含有量上升,表明通心絡(luò)膠囊通過(guò)降低ET-1水平、調(diào)節(jié)TXA2/PGI2穩(wěn)態(tài),改善受損周圍神經(jīng)微血管病變,提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度。
CD34、VWF分別是毛細(xì)血管和較大管徑血管標(biāo)記物[16 -17],文獻(xiàn)報(bào)道CD34抗原的表達(dá)與細(xì)胞增殖關(guān)系十分密切[18],CD34抗原對(duì)血管生成期間的內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和/或轉(zhuǎn)移有一定的影響[19]。VWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,能夠促進(jìn)血小板黏附至內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)[20]。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPN小鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)的CD34、VWF的蛋白和基因表達(dá)均下降,通心絡(luò)膠囊干預(yù)后能明顯上調(diào)CD34、VWF表達(dá),提示通心絡(luò)膠囊通過(guò)促進(jìn)CD34、VWF表達(dá),促進(jìn)坐骨神經(jīng)中血管形成。VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)不同來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖,促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)血管生成[21],臨床上常用血管擴(kuò)張藥改善糖尿病患者血流不足和提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度[22]。通心絡(luò)治療后能夠顯著上調(diào)DPN小鼠坐骨神經(jīng)VEGF的水平,提示我們通心絡(luò)可能通過(guò)升高VEGF表達(dá),促進(jìn)周圍神經(jīng)中毛細(xì)血管新生,進(jìn)而改善DPN。
綜上所述,通心絡(luò)膠囊可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達(dá),改善周圍神經(jīng)微血管病變,促進(jìn)血管形成,提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度,阻滯DPN的發(fā)生發(fā)展。但我們應(yīng)看到中醫(yī)藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變是在整體觀念下的多靶點(diǎn)、多途徑的治療,因此,進(jìn)行系統(tǒng)全面深入的作用機(jī)制研究才能真正地為臨床中藥研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
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*通信作者:張會(huì)欣(1976—),女,博士,從事抗糖尿病藥物研究。Te1:(0311)85901715,E-mai1:hxzhang76@sohu.com
作者簡(jiǎn)介:王 超(1975—),男,博士,從事老年病研究。Te1:(0311)85988007,E-mai1:cwyx163@163.com
基金項(xiàng)目:十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2011ZX09101-004-02);河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2014155)
收稿日期:2014-08-27
doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.040
中圖分類號(hào):R285.5
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B
文章編號(hào):1001-1528(2016)01-0173-04