王 超， 王 曉， 張會欣， 邢邯英， 王 杏， 劉 敏， 張 哲

（1.河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊050051；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室，河北石家莊050035）

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通心絡(luò)膠囊對糖尿病周圍神經(jīng)病變KK/Up j-Ay小鼠血管生成的影響

王 超1， 王 曉1， 張會欣2*， 邢邯英1， 王 杏1， 劉 敏1， 張 哲1

（1.河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊050051；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室，河北石家莊050035）

摘要：目的 觀察通心絡(luò)膠囊對糖尿病周圍神經(jīng)病變KK/Upj-Ay小鼠血管生成的影響。方法 KK/Upj-Ay小鼠隨機(jī)分為模型組、通心絡(luò)高劑量組、通心絡(luò)中劑量組和通心絡(luò)低劑量組，另設(shè)C57BL/6小鼠為對照組。灌胃給藥12周，測定熱痛覺閾值和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）；放免法測定血液中內(nèi)皮素（ET）、血栓素A2（TXA2）和前列環(huán)素（PGI2）含有量；Rea1Time PCR（qPCR）和Western b1ot法測定坐骨神經(jīng)造血祖細(xì)胞抗原（CD34）、血管性血友病因子（VWF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，模型組熱痛覺閾值明顯降低，MNCV明顯減慢（P＜0.01）；ET和TXA2含有量顯著升高（P＜0.01）；小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGFmRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，通心絡(luò)組小鼠痛覺閾值升高，MNCV明顯增快（P＜0.05，P＜0.01）；ET和TXA2含有量明顯降低，PGI2含有量上升（P＜0.05，P＜0.01）；CD34、VWF、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 通心絡(luò)膠囊可調(diào)節(jié)血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達(dá)，改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。

關(guān)鍵詞：通心絡(luò)膠囊；糖尿病周圍神經(jīng)病變；CD34；VWF；VEGF

近年來，盡管糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）在發(fā)病機(jī)制和治療方面取得了很大進(jìn)展，但其機(jī)制仍未闡明，藥物治療也并不十分理想，開發(fā)療效確切的新藥仍是DPN研究的重要課題［1］。本實驗采用由人參、水蛭、全蝎等12味中藥材組方的具有通絡(luò)止痛，益氣活血功效的藥物通心絡(luò)膠囊進(jìn)行干預(yù)［2-3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)對于糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的神經(jīng)癥狀和體征有明顯改善作用，能夠顯著提高周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度［4-5］，而DPN的發(fā)生發(fā)展與微血管病變、血管生成等血管因素密切相關(guān)［6］。本實驗采用DPN小鼠，用通心絡(luò)膠囊加以干預(yù)，觀察通心絡(luò)膠囊對DPN坐骨神經(jīng)血管生成的影響，為深入了解DPN的作用機(jī)制以及臨床用藥提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物 10只25～30 g的SPF級雄性C57BL/6小鼠；40 只30～40 g的SPF級雄性KK/Upj-Ay小鼠。均購自于北京華阜康生物公司，動物合格證號SCXK-（京）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 通心絡(luò)膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號20110501）；內(nèi)皮素（ET）、血栓素A2（TXA2）和前列環(huán)素（PGI2）放免試劑盒購自北京東亞免疫技術(shù)研究所；上海生工生物技術(shù)公司合成造血祖細(xì)胞抗原（CD34）、血管性血友病因子（VWF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）引物；CD34、VWF和VEGF一抗由Abcam公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 7300熒光定量PCR儀采購于ABI公司；凝膠成像分析儀為Biorad公司生產(chǎn)；GC-1200 γ全自動放免分析儀購自中科中佳公司；PowerLab生理記錄儀購自AD Instrument公司。

1.4 動物分組與給藥 按照空腹血糖值（FBG）把KK/ Upj-Ay小鼠（40只）平均分為模型組，通心絡(luò)高、中、低劑量組，10只C57BL/6小鼠設(shè)為對照組。連續(xù)12周，通心絡(luò)高、中、低劑量組每日灌胃給予通心絡(luò)膠囊，分別相當(dāng)于4、2、1 g生藥/kg；對照組與模型組每日根據(jù)小鼠體質(zhì)量，給予相同體積純水［2］。

1.5 熱痛覺閾值測定和坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）測定最后一次給藥結(jié)束后，測定小鼠熱痛覺閾值。以小鼠于55℃恒溫?zé)岚鍍x上的舔足反應(yīng)潛伏期作為痛覺閾值。MNCV在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，連接PowerLab生理記錄儀測得。于小鼠右側(cè)坐骨切跡，踝部與左足底第2趾間分別插入刺激電極與兩個記錄電極，每隔1 min記錄一次雙通道復(fù)合動作電位，取3次的平均值進(jìn)行計算［7-9］（MNCV=兩對記錄電極間距離除以兩通道復(fù)合動作電位潛伏期之差［10］）。

1.6 FBG、ET、TXA2和PGI2含有量測定 最后一次給藥后，用微量血糖儀測定小鼠FBG水平；按放免試劑盒說明書操作測定ET、TXA2和PGI2水平。

1.7 熒光定量PCR方法測定CD34、VWF和VEGFmRNA的表達(dá) 按照實驗標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提取小鼠新鮮坐骨神經(jīng)組織總RNA，參照試劑盒說明加樣后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后再采用熒光定量qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參Gapdh與目的基因引物設(shè)計如下。

CD34引物：正向為5′-GCCTGGAACTAAGTGAAGCAT-3′，反向為5′-GCCAAGACCATCAGCAAAC-3′，產(chǎn)物片段175 bp。VWF引物：正向為5′-CCTGGTGGTAGACTTCGGAA-3′，反向為5′-GCAAACCTGGTCAAGCGT-3′，產(chǎn)物片段108 bp。Vegf引物：正向為5′-TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC-3′，反向為5′-TGGAGTATTTCCGTGACCG-3′，產(chǎn)物片段150 bp。內(nèi)參照Gapdh引物：正向為5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，反向為5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，產(chǎn)物片段143 bp。用儀器自帶的分析軟件，將對照組設(shè)定為1，以相對定量值RQ作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 Western b1ot法檢測CD34、VWF和VEGF蛋白的表達(dá)

提取小鼠坐骨神經(jīng)總蛋白，進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜，封閉后按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟依次加入CD34、VWF、VEGF和GAPDH的一抗以及二抗，顯影后掃描條帶分析其吸光度值，并以CD34、VWF、VEGF與GAPDH的吸光度比值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計［9］。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行ANOVA分析和Dunnett檢驗處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠FBG的變化 給藥12周后，各組小鼠FBG均有變化。與對照組相比，模型組FBG升高明顯（P＜0.01）；與模型組相比，通心絡(luò)組FBG有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1　各組小鼠FBG的變化（±s，n=10）

表1　各組小鼠FBG的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別　　劑量/ （g.kg-1）FBG/（mmo1.L-1）給藥前　　第12周對照組-　5.33±0.81　 5.51±0.88模型組　-　 14.83±2.66**　17.54±2.79**通心絡(luò)低劑量組　1　 14.72±2.78　 16.46±2.44通心絡(luò)中劑量組　2　 14.64±2.61　 15.84±1.86通心絡(luò)高劑量組4　 14.86±2.31　 14.97±2.27

2.2 各組小鼠痛覺閾值及MNCV變化 模型組與對照組小鼠相比，痛覺閾值明顯降低，MNCV明顯減慢（P＜0.01）；與模型組相比，通心絡(luò)中、高劑量組痛覺閾值明顯上升，MNCV明顯增快（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2　各組小鼠痛覺閾值及MNCV的變化（±s，n=10）

表2　各組小鼠痛覺閾值及MNCV的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別　　劑量/ （g.kg-1）痛覺閾值/ （m.s-1）MNCV/ （m.s-1）對照組-　16.99±2.00　 24.44±0.06模型組　-　8.82±1.22**　5.43±1.01**通心絡(luò)低劑量組　1　9.64±1.50　 6.16±1.12通心絡(luò)中劑量組　2　11.50±1.85#　7.82±1.63#通心絡(luò)高劑量組　4　12.63±2.19##　9.54±1.77##

表3　各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化（±s，n=10）

表3　各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化（±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別　　劑量/（g.kg-1）　ET-1/（pg.L-1）　TXA2/（pg.L-1）　PGI2/（pg.mL-1）對照組57.18±10.34　247.16±36.61　88.79±15.69模型組　-　71.06±10.53**　305.22±41.19**　97.10±14.83通心絡(luò)低劑量組　1　66.92±10.94　280.80±43.92　118.03±19.04#通心絡(luò)中劑量組　2　62.86±7.00　278.04±29.08　136.53±23.95##通心絡(luò)高劑量組　4　61.58±7.65#　261.27±30.71##　122.54±17.63 -##

2.3 各組小鼠血液中ET、TXA2和PGI2含有量的變化與對照組比較，模型組小鼠ET和TXA2含有量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡(luò)高劑量組ET和TXA2含有量明顯降低，通心絡(luò)組PGI2含有量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

2.4 坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGFmRNA表達(dá)變化 模型

組CD34、VWF、Vegf mRNA表達(dá)明顯比對照組下調(diào)（P＜0.01）；通心絡(luò)中、高劑量組CD34、VWF、Vegf mRNA表達(dá)均比模型組顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4　各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、Vegf m RNA表達(dá)的變化（±s，n=3）

表4　各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、Vegf m RNA表達(dá)的變化（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

Vegf對照組組別　CD34　VWF 0.90±0.09　 1.16±0.20　 1.15±0.13模型組　0.36±0.06**0.37±0.08**　0.30±0.03**通心絡(luò)低劑量組0.34±0.02　 0.49±0.08　 0.35±0.04通心絡(luò)中劑量組　0.65±0.06##0.61±0.10#　0.70±0.07##通心絡(luò)高劑量組　0.67±0.06##0.70±0.13##　0.75±0.07##

2.5 坐骨神經(jīng)CD34、VWF、VEGF蛋白表達(dá)變化 模型組CD34、VWF、VEGF蛋白表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡(luò)組CD34蛋白表達(dá)顯著上升，中、高劑量組VWF、VEGF蛋白表達(dá)也均顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖1。

表5　各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、VEGF的蛋白表達(dá)（±s，n=3）

表5　各組小鼠坐骨神經(jīng)CD34、VW F、VEGF的蛋白表達(dá)（±s，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

CD34　VWF　VEGF對照組組別0.97±0.13　 1.27±0.20　 0.79±0.09模型組　0.29±0.03**0.42±0.06**　0.28±0.05**通心絡(luò)低劑量組　0.40±0.06#0.53±0.08　 0.36±0.06通心絡(luò)中劑量組　0.45±0.07#　0.68±0.10#　0.53±0.09#通心絡(luò)高劑量組　0.68±0.12#　0.76±0.12#　0.66±0.10##

1.對照組 2.模型組 3.通心絡(luò)低劑量組 4.通心絡(luò)中劑量組 5.通心絡(luò)高劑量組圖1　各組W estern blot結(jié)果

3 討論

在本實驗中，我們采用了具有高血糖、高胰島素抵抗特點的自發(fā)性II型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠，該小鼠表現(xiàn)出低的痛覺閾值及減慢的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，可作為DPN動物模型［11］。我們前期實驗結(jié)果也觀察到了光鏡電鏡下可見坐骨神經(jīng)毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹，管腔狹窄，表明DPN小鼠存在神經(jīng)內(nèi)膜血管病變［12］。

血管障礙、血流動力學(xué)變化及血管活性物質(zhì)減少等是神經(jīng)微血管病變的重要表現(xiàn)。ET是已知的強(qiáng)血管收縮劑，ET大量釋放可通過影響血流動力學(xué)的改變參與微血管病變的發(fā)病機(jī)制［13］。TXA2是一種重要的縮血管物質(zhì)，而PGI2是一種重要的抑制血管收縮物質(zhì)，兩者之間的動態(tài)平衡失調(diào)最終導(dǎo)致缺血、缺氧性神經(jīng)損害。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DPN患者給予前列腺素E1治療能顯著改善患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［14］。因TXA2、PGI2非常容易自發(fā)水解成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物：TXB2與6-Keto-PGF1a，所以測定TXB2、6-K-PGF1a的含有量可以分別反映TXA2和PGI2的含有量［15］。我們實驗發(fā)現(xiàn)DPN小鼠TXA2/PGI2的平衡被破壞，給予通心絡(luò)膠囊治療后，血液中ET-1水平下降，TXA2代謝物TXB2含有量下降，PGI2代謝物6-K-PGF1 a含有量上升，表明通心絡(luò)膠囊通過降低ET-1水平、調(diào)節(jié)TXA2/PGI2穩(wěn)態(tài)，改善受損周圍神經(jīng)微血管病變，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

CD34、VWF分別是毛細(xì)血管和較大管徑血管標(biāo)記物［16 -17］，文獻(xiàn)報道CD34抗原的表達(dá)與細(xì)胞增殖關(guān)系十分密切［18］，CD34抗原對血管生成期間的內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和/或轉(zhuǎn)移有一定的影響［19］。VWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，能夠促進(jìn)血小板黏附至內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)［20］。我們實驗發(fā)現(xiàn)DPN小鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)的CD34、VWF的蛋白和基因表達(dá)均下降，通心絡(luò)膠囊干預(yù)后能明顯上調(diào)CD34、VWF表達(dá)，提示通心絡(luò)膠囊通過促進(jìn)CD34、VWF表達(dá)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)中血管形成。VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，能促進(jìn)不同來源內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管生成［21］，臨床上常用血管擴(kuò)張藥改善糖尿病患者血流不足和提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度［22］。通心絡(luò)治療后能夠顯著上調(diào)DPN小鼠坐骨神經(jīng)VEGF的水平，提示我們通心絡(luò)可能通過升高VEGF表達(dá)，促進(jìn)周圍神經(jīng)中毛細(xì)血管新生，進(jìn)而改善DPN。

綜上所述，通心絡(luò)膠囊可以通過調(diào)節(jié)血管活性因子、升高CD34、VWF、VEGF表達(dá)，改善周圍神經(jīng)微血管病變，促進(jìn)血管形成，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，阻滯DPN的發(fā)生發(fā)展。但我們應(yīng)看到中醫(yī)藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變是在整體觀念下的多靶點、多途徑的治療，因此，進(jìn)行系統(tǒng)全面深入的作用機(jī)制研究才能真正地為臨床中藥研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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*通信作者：張會欣（1976—），女，博士，從事抗糖尿病藥物研究。Te1：（0311）85901715，E-mai1：hxzhang76@sohu.com

作者簡介：王 超（1975—），男，博士，從事老年病研究。Te1：（0311）85988007，E-mai1：cwyx163@163.com

基金項目：十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX09101-004-02）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2014155）

收稿日期：2014-08-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.040

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0173-04