周小軍，汪 蕓，張麗娟，林葆睿

(1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東中山 528401; 2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，廣東中山 528401)

FAM150B甲基化致低表達(dá)與鼻咽癌氣虛癌變研究*

周小軍1，汪 蕓2，張麗娟1，林葆睿1

(1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東中山 528401; 2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，廣東中山 528401)

目的:采用甲基化芯片及免疫組化研究FAM150B甲基化及其蛋白的表達(dá)。方法:3例鼻咽癌發(fā)病前后配對(duì)患者，采用甲基化芯片技術(shù)檢測FAM150B甲基化，隨機(jī)選擇100例患者，包括鼻咽癌和鼻咽炎各50例及氣虛質(zhì)44例和正常質(zhì)56例。采用免疫組化方法檢測FAM150B蛋白的表達(dá)。結(jié)果:FAM150B在鼻咽癌為高甲基化，F(xiàn)AM150B蛋白在鼻咽炎為高表達(dá)，在鼻咽癌為低表達(dá)，其表達(dá)值分別為(0.995±0.511，0.257±0.392);FAM150B蛋白在正常質(zhì)為高表達(dá)，在氣虛質(zhì)為低表達(dá)，其表達(dá)值分別為(0.765±0.615，0.449±0.498)。結(jié)論:FAM150B甲基化致其低表達(dá)為鼻咽癌及氣虛質(zhì)的特征，F(xiàn)AM150B為鼻咽癌氣虛癌變的分子指標(biāo)。

鼻咽癌;FAM150B;氣虛;甲基化

鼻咽癌為好發(fā)于廣東的具有明顯地域性及家族聚集性特點(diǎn)的惡性腫瘤。中醫(yī)腫瘤學(xué)認(rèn)為，“正氣虛則成巖”(《外證醫(yī)案匯編·乳巖附論》)，臨床亦發(fā)現(xiàn)氣虛為鼻咽癌易感體質(zhì)且貫穿于鼻咽癌發(fā)生的始終［1］。那么氣虛如何導(dǎo)致鼻咽癌癌變?其氣虛癌變的分子基礎(chǔ)是什么?早期研究［2］發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌發(fā)生癌變后，F(xiàn)AM150B基因發(fā)生了明顯的高甲基化改變。但是FAM150B基因高甲基化與鼻咽癌變以及與氣虛質(zhì)的關(guān)系如何有待于進(jìn)一步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例標(biāo)本

病例標(biāo)本來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院門診病例。甲基化芯片標(biāo)本:3例鼻咽癌發(fā)病前(鼻咽炎)、發(fā)病后(鼻咽非角化性癌)配對(duì)標(biāo)本，2男1女，年齡分別為60歲、54歲、50歲。免疫組化標(biāo)本:于我院病理科保存的鼻咽疾病石蠟組織塊中按中醫(yī)體質(zhì)分層隨機(jī)抽出鼻咽癌及鼻咽炎各50例，其中鼻咽癌男性31例，女性19例，平均年齡(46.6±12.9)歲，氣虛質(zhì)25例，正常質(zhì)25例;鼻咽炎男性26例，女性24例，平均年齡(35.3±10.7)歲，氣虛質(zhì)19例，正常質(zhì)31例。

1.2 主要試劑及儀器

Roche-NimbleGen CpG promoter芯片(美國)，芯片覆蓋所有UCSC注釋的CpG島和所有RefSeq數(shù)據(jù)庫基因的啟動(dòng)子區(qū)(產(chǎn)品目錄號(hào)00892)，探針覆蓋轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游800 bp至下游200 bp以及28226個(gè)CpG島。

FAM150B兔抗人單克隆抗體，北京四方柏生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(編號(hào)WA-0374R);即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品(編號(hào)KIT-5030);抗原熱修復(fù)試劑，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(編號(hào)C-0017)。

1.3 方法

1.3.1 甲基化芯片技術(shù)檢測鼻咽癌發(fā)病前后甲基化特征 應(yīng)用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取鼻咽組織DNA。用超聲將DNA打斷成200 bp-500 bp DNA片斷，再進(jìn)行甲基化DNA免疫共沉淀。加熱變性后的單鏈DNA樣品分成2份，其中1份樣品加入5'-甲基化胞嘧啶核抗體即MeDIP，另1份不加即Input;用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DNA片斷的抗體復(fù)合物，清冼樣品中非甲基化DNA片段，純化免疫共沉淀的DNA片段。使用Sigma WAG Kit對(duì)上述2份 DNA片斷進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記(MeDIP以Cy5標(biāo)記，對(duì)照Input用Cy3標(biāo)記)，再進(jìn)行芯片雜交，標(biāo)記后的MeDIP與Input樣品混合、變性，與甲基化微陣列芯片雜交。芯片上每個(gè)探針的Cy5/Cy3強(qiáng)度比例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。最后采用高解析度芯片掃描儀檢測雜交信號(hào)，專業(yè)分析軟件對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、標(biāo)準(zhǔn)化和峰值分析。

1.3.2 免疫組化檢測方法 利用PBS代替一抗做空白對(duì)照，已知陽性切片做陽性對(duì)照?？乖迯?fù)采用酸性修復(fù)方法，枸櫞酸緩沖液(pH6.0)隔水煮沸(沸水浴約92～95℃)修復(fù)15 min，自然涼至室溫。山羊血清封閉，37℃孵育20 min。待測抗體孵育4℃過夜，再按免疫組化試劑盒說明書操作。

免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)分方法:以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃至棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，辨別陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞，并計(jì)算每個(gè)視野的陽性表達(dá)率。計(jì)算方法［3］:計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞總數(shù)。陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/ (陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。同時(shí)，對(duì)每張切片的陽性表達(dá)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:無染色為0分，淺黃色1分，深黃色2分，黃褐色為3分。陽性表達(dá)值=陽性表達(dá)率×染色強(qiáng)度分值。

1.3.3 中醫(yī)體質(zhì)診斷 氣虛質(zhì)以長期疲倦感、易汗出、舌淡紅、脈弱等為主要特征，正常質(zhì)氣血陰陽平和之人，無寒熱偏向及虛弱表現(xiàn)。體質(zhì)分類標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)［1］。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以其陽性表達(dá)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，氣虛質(zhì)鼻咽癌及氣虛質(zhì)鼻咽炎FAM150B比較采用t檢驗(yàn)。氣虛質(zhì)與正常質(zhì)FAM150B比較，將疾病(鼻咽炎、鼻咽癌)作為協(xié)變量，鼻咽癌與鼻咽炎FAM150B的比較，將氣虛質(zhì)作為協(xié)變量，采用協(xié)方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌發(fā)病前后CpG島及啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

3例鼻咽癌患者從發(fā)病前到發(fā)病后CpG島發(fā)生了明顯的甲基化，甲基化峰分別從癌變前1086個(gè)、2359個(gè)、2810個(gè)上升到癌變后的2708個(gè)、3510個(gè)、3246個(gè)。且甲基化主要集中在啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)甲基化峰分別從癌變前231個(gè)、1134個(gè)、820個(gè)上升到癌變后的1336個(gè)、1769個(gè)、1626個(gè)。

FAM150B基因的啟動(dòng)子區(qū) CpG島(chr2: 277353-280099)，在3例鼻咽癌發(fā)病前均未出現(xiàn)甲基化，而在鼻咽癌發(fā)生癌變后均出現(xiàn)甲基化峰。

2.2 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質(zhì)與正常質(zhì)FAM150B的表達(dá)

表1圖1顯示，F(xiàn)AM150B蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，細(xì)胞核亦有表達(dá);陽性表達(dá)為黃色，依表達(dá)強(qiáng)度不同可分別顯現(xiàn)為淺黃色、深黃色或黃褐色。FAM150B蛋白在鼻咽炎為高表達(dá)(陽性范圍廣且陽性程度深)，而在鼻咽癌為低表達(dá)甚至不表達(dá)，按中醫(yī)體質(zhì)分組，F(xiàn)AM150B蛋白在正常質(zhì)為高表達(dá)，而在氣虛質(zhì)為低表達(dá)。

表1 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質(zhì)與正常質(zhì)FAM150B的表達(dá)(±s)

表1 鼻咽癌與鼻咽炎、氣虛質(zhì)與正常質(zhì)FAM150B的表達(dá)(±s)

注:與鼻咽炎比較:*F=63.166，P＜0.01;與正常質(zhì)比較:△F= 6.523，P＜0.05

組 別 例數(shù)FAM150B鼻咽癌 50 0.257±0.392*鼻咽炎 50 0.995±0.511氣虛質(zhì) 44 0.449±0.498△正常質(zhì)56 0.765±0.615

2.3 氣虛質(zhì)鼻咽癌、正常質(zhì)鼻咽癌、氣虛質(zhì)鼻咽炎、正常質(zhì)鼻咽炎FAM150B的表達(dá)

FAM150B在鼻咽癌及氣虛質(zhì)均表現(xiàn)為低表達(dá)，表2顯示，F(xiàn)AM150B依氣虛質(zhì)鼻咽癌、正常質(zhì)鼻咽癌、氣虛質(zhì)鼻咽炎、正常質(zhì)鼻咽炎次序逐漸升高(F =25.316，P＜0.01);兩兩比較顯示，除外氣虛質(zhì)鼻咽癌與正常質(zhì)鼻咽癌比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，其余比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 氣虛質(zhì)鼻咽癌、正常質(zhì)鼻咽癌、氣虛質(zhì)鼻咽炎、正常質(zhì)鼻咽炎FAM150B的表達(dá)(±s)

表2 氣虛質(zhì)鼻咽癌、正常質(zhì)鼻咽癌、氣虛質(zhì)鼻咽炎、正常質(zhì)鼻咽炎FAM150B的表達(dá)(±s)

注:與氣虛質(zhì)鼻咽癌比較:＊＊P＜0.01;與正常質(zhì)鼻咽癌比較:△△P＜0.01;與氣虛質(zhì)鼻咽炎比較:※P＜0.05

組別 例數(shù)FAM150B氣虛質(zhì)鼻咽癌25 0.176±0.334正常質(zhì)鼻咽癌 25 0.339±0.434氣虛質(zhì)鼻咽炎 19 0.808±0.451＊＊△△正常質(zhì)鼻咽炎 31 1.109±0.518＊＊△△※

圖1 FAM150B在氣虛質(zhì)及正常質(zhì)鼻咽炎及鼻咽癌上皮中的表達(dá)(免疫組化染色 ×400)

3 討論

表觀遺傳學(xué)主要研究在沒有DNA序列改變情況下，基因功能可逆和可遺傳的改變其重要內(nèi)容之一為甲基化，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常高甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制，DNA甲基化成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)［4］。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說認(rèn)為，體質(zhì)是在先天遺傳基礎(chǔ)上經(jīng)后天飲食環(huán)境共同作用形成的，表觀遺傳中的DNA序列不變而功能可變的特性與中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說具有極大的相似性，因而從甲基化角度從事中醫(yī)研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)研究內(nèi)容。

運(yùn)用高通量甲基化芯片技術(shù)篩選出在鼻咽癌發(fā)病前后出現(xiàn)了特異性高甲基化的FAM150B基因，再通過病例對(duì)照研究FAM150B蛋白在氣虛質(zhì)及鼻咽癌的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在鼻咽癌癌變后FAM150B基因出現(xiàn)了明顯的甲基化且其蛋白為低表達(dá)或不表達(dá)，故認(rèn)為FAM150B基因高甲基化致其低表達(dá)為鼻咽癌癌變特征，推測FAM150B可能為鼻咽癌的抑癌基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM150B在氣虛質(zhì)為低表達(dá)(相比于正常質(zhì))且依氣虛質(zhì)鼻咽癌、正常質(zhì)鼻咽癌、氣虛質(zhì)鼻咽炎、正常質(zhì)鼻咽炎次序表達(dá)逐漸升高，故認(rèn)為FAM150B基因高甲基化致其蛋白的低表達(dá)為鼻咽癌氣虛癌變的特征。

FAM150B(family with sequence similarity 150，member B)，Gene ID:285016，染色體定位于2p25.3。為序列相似性家族成員之一，序列相似性家族成員可廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)組織，其功能可能與細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞的增殖分化、成熟與凋亡有關(guān)，這個(gè)家族中成員在癌癥發(fā)病過程中起重要作用。有研究表明［5］，在細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化過程中，此家族成員染毒前呈非甲基化狀態(tài)，而在轉(zhuǎn)化前和轉(zhuǎn)化后呈甲基化狀態(tài)，可能成為化學(xué)毒物暴露監(jiān)測及腫瘤預(yù)測的生物標(biāo)志物。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果相類似。

鼻咽癌氣虛致癌是一個(gè)重要命題，相關(guān)專家［6］也作了有益的探索，發(fā)現(xiàn)氣虛質(zhì)鼻咽癌存在著特定的蛋白表達(dá)差異，這肯定了研究方向。但因氣虛是一種亞健康態(tài)，與很多疾病有關(guān)，氣虛致癌與否以及如何致癌一直難以具體說明。本課題組的研究思路是先確定與鼻咽癌發(fā)病有關(guān)的致癌蛋白，再研究其是否在氣虛質(zhì)中存在表達(dá)差異，最后篩選確認(rèn)FAM150B為鼻咽癌氣虛致癌標(biāo)志蛋白。

高甲基化致其低表達(dá)可能是抑癌基因參與癌變的重要方式，如抑癌基因FHIT在乳腺癌、肺癌、胃腺癌等多種腫瘤的發(fā)生過程中都發(fā)生了甲基化而呈現(xiàn)低表達(dá)，而這種生理病理過程與中醫(yī)證型有關(guān)。FHIT基因在陽虛組的甲基化表達(dá)有增加的趨勢［7］，與本研究結(jié)果相類似。FAM150B致鼻咽癌氣虛癌變是否有代表性和普遍性，有待于進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

［1］周小軍，田道法．鼻咽癌家系成員體質(zhì)調(diào)查研究［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8(11):860-863．

［2］周小軍，陳江華，王士貞，等．鼻咽癌癌變前后 ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4甲基化研究［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，39(3):341-344．

［3］汪蕓，王書芹，周小軍，等．CyclinD1和Skp-2在鼻咽癌及癌前病變中的表達(dá)及其病理意義研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2013，21(3):171-173．

［4］Esteller M，Corn PG，Baylin SB，et al．A gene hypermethylation profile of human cancer［J］．Cancer Res，2001，61:3225-3229．

［5］曾君玲，張波，楊萍，等．細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化過程中差異甲基化基因的篩選［J］．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45(5):404-409．

［6］陳舒華，田道法，張繼平，等．鼻咽癌高癌家系癌患者不同體質(zhì)證型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2013，21(1):5-9．

［7］曾躍琴，李煒弘，張?zhí)於穑龋I陽虛證免疫相關(guān)基因CPG島調(diào)控機(jī)制研究［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24(6):1515-1517．

Research of FAM150B Methylation leads to its Low Expression and Qi Deficiency Related to Nasopharyngeal Carcinoma

ZHOU Xiao-jun1，WANG Yun2，ZHANG Li-juan1，LIN Bao-rui1
(1．Department of Otorhinolaryngology，Affiliated Zhongshan Hospital of Guangzhou University of TCM，Zhongshan，Guangdong 528401，China;2．Department of Pathology，Affiliated Zhongshan Hospital of Guangzhou University of TCM，Zhongshan，Guangdong 528401，China)

Objective:FAM150B methylation and its expression in nasopharyngeal carcinoma and the qi deficiency were studied by methylation chip technology and immunohistochemical method．Method:3 patients with nasopharyngeal carcinoma before and after the onset of matching，using methylation chip technology to detect FAM150B methylation，100 patients by randomly selected，including 50 cases of nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis，including qi deficiency of 44 cases and normal 56 cases，using immunohistochemical method to detect FAM150B protein expression．Results: FAM150B for high methylation in nasopharyngeal carcinoma，F(xiàn)AM150B protein for high expression in nasopharyngitis，for lower expression in nasopharyngeal carcinoma，the expression values were 0.995±0.511 and 0.257±0.392 respectively．FAM150B protein expressed in normal quality is high，the qi deficiency of quality for lower expression，the expression values were 0.765±0.615 and 0.449±0.498 respectively．Conclusion:FAM150B methylation to its lower expression in nasopharyngeal carcinoma and the qi deficiency of qualitative characteristics，F(xiàn)AM150B may be molecular indicator of qi deficiency for nasopharyngeal cancer．

Nasopharyngeal Carcinoma;FAM150B;Qi Deficiency; Methylation

R739．63

B

1006-3250(2016)01-0096-03

2015-04-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81072847，81373698)

周小軍，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事鼻咽癌中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究。