黃燕瓊，秦華珍，余騰飛，劉 穎，譚喜梅，李文強，翁銘鉆，張興燊，王 勤

(1．廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011;2．廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠交感神經-腎上腺機能的影響*

黃燕瓊1，秦華珍2△，余騰飛2，劉 穎2，譚喜梅2，李文強2，翁銘鉆2，張興燊2，王 勤2

(1．廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011;2．廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

目的:觀察干姜等10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠尿17-OHCS與CAs以及血清ACTH、D-β-H的影響，探討其對胃實寒證大鼠交感神經-腎上腺系統(tǒng)機能的影響，揭示10味藥的溫熱藥性本質。方法:除空白組外，其余動物灌服知母冰水液建立胃實寒證模型。造模成功后分為模型組、陽性組、干姜等10個溫中散寒藥組以及石膏、黃連2個反性藥對照組，給藥3次后檢測尿液17-OHCS及CAs含量和血清ACTH、D-β-H含量。結果:模型組大鼠尿液中17-OHCS、CAs、血清中ACTH、D-β-H含量均降低，各治療組大鼠均顯著升高。結論:10味溫中散寒藥有提高胃實寒證大鼠交感神經-腎上腺機能的作用，通過增強機體交感神經-腎上腺機能而呈現(xiàn)其溫熱藥性。

溫中散寒藥;胃實寒證;17-OHCS;CAs;ACTH;D-β-H;交感神經-腎上腺機能;藥性本質

中藥藥性理論是中藥最重要的學術特征，中藥的寒熱溫涼四性在藥性理論中居首要地位?！隘熀詿崴帯薄ⅰ隘煙嵋院帯?，古往今來一直是指導臨床用藥的綱領，因此在中藥藥性理論研究中受到高度重視。而溫中散寒藥是溫熱藥性最為突出的一類藥物，此類藥以溫中散寒為主要功效，臨床主要用于脾胃實寒證［1］。為研究溫中散寒藥的藥性本質，揭示溫熱藥性的科學內涵，本研究在中醫(yī)藥理論指導下，以臟腑辨證為核心，以寒熱辨證為綱要，選擇歸脾胃經的干姜、高良姜、丁香、小茴香、吳茱萸、肉桂、花椒、胡椒、蓽茇、蓽澄茄共10味溫中散寒藥為研究對象，以歸胃經的知母冰水煎液復制大鼠胃實寒證模型，選取辛熱入脾的附子作為陽性對照藥，并選取歸胃經的寒性藥石膏、黃連作為反性對照藥，觀察10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠尿液17-羥皮質類固醇(17-OHCS)、兒茶酚胺類物質(CAs)包括腎上腺素(Ad)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)的影響，以及對血清促腎上腺皮質素(ACTH)、多巴胺β羥化酶(D-β-H)的影響，探討其對交感神經-腎上腺機能的影響，探尋溫中散寒藥的溫熱藥性本質，以揭示中藥藥性理論的科學內涵，現(xiàn)就研究結果作一報道。

1 材料

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠，體質量(220±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 藥品

知母、附子、干姜、高良姜、丁香、小茴香、吳茱萸、肉桂、花椒、胡椒、蓽茇、蓽澄茄、石膏、黃連等均購自南寧生源中藥飲片有限責任公司(生產批號分別為 111209，110113，110914，110608，111027，110824，110928，110927，110815，111021，110927，110921，110402，111014)。經廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室田慧教授鑒定均為2010版藥典收載品種。取知母1 kg加10倍量的水充分浸透，武火煮開后轉文火保持微沸1 h過濾，藥渣加8倍量水再煎40 min過濾，合并2次濾液濃縮至0.5 g/ml生藥濃度，分裝保存于4℃冰箱備用。其余各種藥物按照上法煎煮濃縮至所需濃度備用。

1.3 試劑

硫酸銨(高純，批號20101025)，天津市精細化工研究所;甲醇(色譜純，批號113904)，美國天地公司;正丁醇(色譜純，批號1112386)，美國費氏公司;濃鹽酸(批號20120621)，廉江市愛廉化工試劑有限公司;醋酸鈉(批號20110105)，天津博迪化工股份有限公司;濃硫酸(批號20120503)，廉江市愛廉化工試劑有限公司;氫氧化鈉(批號F20110110)，國藥集團化學試劑有限公司;氧化鋁(批號20090906)，成都市科隆化工試劑廠;氯仿(批號1208272)，西隴化工股份有限公司;無水乙醇(批號20120409)，成都市科隆化工試劑廠。ACTH酶免試劑盒，加拿大ELIXIR醫(yī)藥公司(批號051SC-Jul2013);DβH酶免試劑盒，上海越研生物科技有限公司(批號201212)。

1.4 主要儀器

BP211D萬分之一克電子天平，德國賽多利斯生產;HVE-50自動高壓滅菌器，日本Hirayama公司;SAITEXIANGYI．PGL-16冷凍離心機，湖南賽特湘儀離心機公司;PHS-3C型酸度計，上海盛磁儀器有限公司;RF5301PC型熒光分光光度計，日本島津;e2695高效液相色譜儀系統(tǒng)，美國 Waters; SAITEXIANGYI．PGL-16冷凍離心機，湖南賽特湘儀離心機公司;EPOCH BIOTEK全波長酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;TS-2000A其林貝爾脫色搖床，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 動物造模與分組

實驗分2批進行，每批取大鼠150只，隨機取10只作為空白對照組，參照文獻［2-3］并結合前期工作基礎［4］，其余動物給予灌服濃度為19.44 g/kg的4℃冰知母水煎液復制胃實寒證模型，給藥體積20 ml/kg，給藥次數(shù)每日2次，共給藥2 d。造模完成后按隨機數(shù)字表法分成模型組、陽性對照組、干姜組、高良姜組、丁香組、小茴香組、吳茱萸組、肉桂組、花椒組、胡椒組、蓽茇組、蓽澄茄組各治療藥組以及石膏組、黃連組反性對照組。

2.2 給藥與取材方法

空白組、模型組灌服常溫自來水，陽性組灌服附子水煎液，其余各組灌服相應的藥物提取液，給藥體積10 ml/kg，各組給藥劑量為成人臨床用量上限的10倍。根據臨床實寒證屬新病、急病，治療及時易于康復的特點，每隔12 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。末次給藥前各組大鼠禁食不禁水12 h，給藥后立即放入代謝籠內，收集24 h尿液，取出尿液2000 r/ min下離心10 min，吸取上清液3mL用于17-OHCS的測定，另取10mL用于CAs類物質的測定。

2.3 尿液中17-OHCS含量的熒光測定［5-6］

取上清尿液3 ml，加56硫酸調節(jié)尿液pH到1，加硫酸銨3 g搖勻再加氯仿∶正丁醇=10∶1(v/v)的混合液33 ml，抽提5 min，混合液倒入2個20 lL尖底離心管內，1500 r/min離心棄去上層水液，各管吸出10 ml抽提液于15 ml具塞試管內，一管做尿空白，另一管用于尿顯色測定，另作56硫酸空白管、標準顯色管。各管加塞抽提5 min，1500 r/min離心15 min，吸出各管硫酸層于15 ml試管內，60℃水浴保溫42 min，用流動水冷卻到室溫，用分光光度計在波長為410 nm下檢測。

冬凌草為一種多年生的草本植物，含有難分解利用的纖維素與半纖維素。因此，篩選適宜發(fā)酵的菌種，對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，可以最大限度地利用以中藥材為主要組分的培養(yǎng)基，釋放和產生更多的活性物質。黑曲霉是一種飼用真核微生物，能產生分解纖維素、半纖維素、蛋白質和脂類等物質的酶類，對纖維素具有較強的分解利用能力，是發(fā)酵中藥的主要功能菌。本實驗中以冬凌草為原料，同時添加適量的麩皮作為輔料，接種黑曲霉進行固態(tài)發(fā)酵時，由于麩皮含有豐富的蛋白質、礦物質、維生素等營養(yǎng)物質，黑曲霉生長良好，纖維素酶的活性也較高。

2.4 尿液中CAs含量的高效液相測定［7-8］

混勻尿液后取10 ml儲存?zhèn)溆?，氧化鋁吸附法處理，再進行稀釋得到6個濃度的標準品，分別取不同濃度的對照溶液用C18柱4.6 mm×250 mm，直徑5 μm，Ex280 nm，Em310 nm，流速0.8 mL·min－1，流動相甲醇－0.02 moL·L－1磷酸二氫鉀(2∶98=v∶v)，2 ml 0.2 moL·L－1醋酸洗脫，pH3.0，0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣15 min，100 μL進樣，測定其峰面積。

2.5 血清中ACTH、D-β-H含量的測定

末次給藥后2 h腹腔注射10%水合氯醛3 ml/ kg麻醉大鼠，腹主動脈采血加入離心管中。室溫放置待凝固后，用離心機4℃、3000 r/min離心10 min，取上清部分，按照試劑盒說明書的操作步驟測定血清ACTH、D-β-H含量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據以均數(shù)±標準差(±s)表示，符合正態(tài)性和方差齊性的資料采用單因素方差分析，不符合正態(tài)性和方差齊性的資料采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對胃實寒證大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影響

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠尿液17-OHCS、CAs含量均顯著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。與模型組比較，除小茴香組尿液17-OHCS含量雖升高但差異不明顯外，其余各溫中散寒藥組尿液17-OHCS、NE、Ad、DA含量均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)。反性藥石膏組、黃連組與空白組比較，17-OHCS、CAs含量均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);與模型組比較，17-OHCS、DA含量顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，Ad、NE含量比較差異無統(tǒng)計學意義。10味溫中散寒藥組與2味反性對照藥組比較，在對尿液17-OHCS含量的影響方面，高良姜、蓽茇、蓽澄茄組有顯著或非常顯著的影響(P＜0.01或P＜0.05)，干姜與石膏組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與黃連組比較雖無統(tǒng)計學意義，但數(shù)值升高;其余6味藥17-OHCS含量統(tǒng)計雖差異無統(tǒng)計學意義，但均高于2味反性對照藥組。在對尿液CAs含量影響方面，10味溫中散寒藥尿液NE、Ad、DA含量均明顯增加，與2味反性對照藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影響(±s)

表1 10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠尿液17-OHCS、CAs含量的影響(±s)

注:與空白組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與反性組石膏比較:ssP＜0.01;與反性組黃連比較:qP＜0.05，qqP＜0.01(表2同)

組 別 鼠數(shù) 劑量(g·kg－1) 17-OHCS含量(μg·24 h－1) CAs 含量NE含量(ng·24 h－1) Ad含量(ng·24 h－1) DA含量(ng·24 h－1)空 白 組 10 — 11.16±2.18 185.97±10.64 81.82± 7.82 326.63±7.42模 型 組 10 — 7.76±1.28Δ 79.95± 4.00ΔΔ 48.04± 1.47ΔΔ 35.34± 1.17ΔΔ附 子 組 10 13.50 14.47±1.93＊＊sq 261.73± 3.85s＊＊sqq 179.02± 5.35＊＊ssqq 554.74± 2.91＊＊ssqq干 姜 組 10 8.10 14.32±2.96*s 332.36± 1.67＊＊ssqq 196.68± 1.05＊＊ssqq 360.26± 3.45＊＊ssqq高良 姜 組 10 5.40 17.69±3.07＊＊ssq 133.34± 6.19＊＊ssqq 88.10± 5.33＊＊q 164.92±16.39＊＊qq丁 香 組 10 2.70 10.99±3.43* 279.00± 2.23＊＊ssqq 156.99± 2.89＊＊ssqq 261.42±14.46＊＊ssqq小茴 香 組 10 5.40 8.19±1.24 465.53±11.34＊＊ssqq 277.47±21.30＊＊ssqq 945.15±12.78＊＊ssqq吳 茱 萸 組 10 4.05 17.85±7.61* 270.22±14.99＊＊ssqq 121.78± 4.52＊＊ssqq 234.72± 1.14＊＊ssqq肉 桂 組 10 4.05 12.44±3.25* 173.05± 7.03＊＊ssqq 99.24± 1.94＊＊ssqq 243.40± 4.63＊＊ssqq花 椒 組 10 5.40 13.19±2.89＊＊ 243.87± 2.64＊＊qq 113.68± 3.83＊＊ssqq 205.44± 5.44＊＊ssqq胡 椒 組 10 8.10 15.87±7.39* 151.33± 3.44＊＊ssqq 104.31± 1.34＊＊ssqq 159.93± 3.47＊＊qq蓽 茇 組 10 2.70 20.21±3.30＊＊ssqq 353.18± 5.35＊＊ssqq 292.43±27.23＊＊ssqq 881.63±11.96ssqq蓽 澄 茄 組 10 2.70 21.58±2.47＊＊ssqq 219.30± 2.25＊＊ssqq 113.46± 1.76＊＊ssqq 176.84± 1.63＊＊ssqq石 膏 組 10 54.00 8.21±1.39Δ* 167.66± 4.82Δ 53.17± 1.42ΔΔ 162.06± 2.20ΔΔ＊＊黃 連 組 10 4.50 9.30±1.65Δ* 121.77± 1.28ΔΔ 49.42± 1.27ΔΔ 111.82± 0.17ΔΔ＊＊

3.2 對大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影響

表2 10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影響(±s)

表2 10味溫中散寒藥對胃實寒證大鼠血清ACTH、D-β-H含量的影響(±s)

組 別 例數(shù)劑量(g/kg) ACTH含量(pg/mL) D-β-H含量(ng/mL)空 白 組 10 —148.36±17.53 328.74±38.56模 型 組 10 — 114.32± 5.68ΔΔ 278.56±61.59Δ附 子 組 10 13.50 152.13±10.08＊＊ssqq 1138.52±144.68＊＊ssqq干 姜 組 10 8.10 149.58± 8.32＊＊ssqq 613.37± 81.38＊＊ssqq高良姜組 10 5.40 149.87±25.53*ssqq 633.35± 88.46＊＊ssqq丁 香 組 10 2.70 162.25±26.04＊＊ssqq 572.83± 69.48＊＊ssqq小茴香組 10 5.40 141.06±13.37＊＊ssqq 637.18±136.01＊＊ssqq吳茱萸組 10 4.05 132.87±22.45*ssqq 612.80±111.93＊＊ssqq肉 桂 組 10 4.05 127.86±16.51*ssqq 518.08± 32.17＊＊ssqq花 椒 組 10 5.40 149.81±22.53＊＊ssqq 522.59± 35.08＊＊ssqq胡 椒 組 10 8.10 141.56±24.93*ssqq 566.98± 49.41＊＊ssqq蓽 茇 組 10 2.70 156.82± 8.53＊＊ssqq 564.28± 17.84＊＊ssqq蓽澄茄組 10 2.70 146.94±29.42*ssqq 573.44± 24.94＊＊ssqq石 膏 組 10 54.00 88.33±12.55ΔΔ＊＊ 301.28± 60.90Δ黃 連 組 10 4.50 92.38±17.97ΔΔ* 311.84±53.69Δ

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清ACTH、D-β-H含量顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05)。與模型組比較，各溫中散寒藥組大鼠血清ACTH、D-β-H含量均顯著升高(P＜0.01或 P＜ 0.05)。反性藥石膏組、黃連組與空白組及模型組比較，大鼠血清ACTH含量顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);D-β-H含量與空白組比較均顯著降低(P＜0.05)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。另外，10味溫中散寒藥組與2味反性對照藥組比較，血清ACTH、D-β-H含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

4 討論

17-OHCS主要是腎上腺皮質分泌的皮質醇、皮質素及其代謝產物，主要由腎臟排出，測定給藥后尿內17-OHCS的排出量，可以反映腎上腺皮質激素的釋放機能［9］。當腎上腺皮質功能亢進時，17-OHCS的排出量增加。CAs包括Ad、NE及DA 3種物質。腎上腺髓質嗜鉻細胞分泌Ad和NE;DA主要由交感神經節(jié)及中樞神經細胞產生，是NE生物合成的前體，可促進NE的釋放。24 h尿中CAs排出量代表CAs類物質全天的代謝量，能較準確地反映腎上腺髓質功能。當腎上腺髓質功能亢進時，CAs排出量增高。ACTH是由腦垂體前葉分泌的激素，具有刺激腎上腺皮質發(fā)育和機能的作用。DβH存在于腎上腺髓質嗜鉻顆粒和交感神經末梢的貯存囊泡內。交感神經興奮時，DβH與NE通過細胞外溢方式，成比例地從交感神經末梢釋放。在CAs生物合成中，DβH促使多巴胺β位上羥化而形成NE，它在交感神經-腎上腺素系統(tǒng)的傳遞中起重要作用。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠尿液17-OHCS、CAs排泄量及血清ACTH、DβH含量均明顯減少，證明胃實寒證時交感神經-腎上腺機能下降。分別給予10味溫中散寒藥治療后，尿液17-OHCS、CAs排泄量及血清ACTH、DβH含量均有不同程度升高，說明溫中散寒藥有提高胃實寒證大鼠交感神經-腎上腺系統(tǒng)機能活動的作用。其影響途徑可能是通過促進ACTH分泌，使腎上腺皮質激素分泌增加，17-OHCS水平升高;興奮交感神經，使腎上腺髓質功能增強，DβH的釋放增加，CAs的水平升高。

梁月華等［10］報道，交感神經-腎上腺系統(tǒng)機能活動的減弱和增強分別是寒證和熱證形成的重要因素。溫熱藥有提高交感神經-腎上腺(皮質、髓質)系統(tǒng)機能活動的作用，寒涼藥與之相反。本研究選擇10味溫熱藥性突出的溫中散寒藥，采用施加寒涼因素的辦法復制胃實寒證模型，對其交感神經-腎上腺機能的影響進行研究。本實驗結果與梁月華等觀點相符合，說明10味溫中散寒藥可以通過增強機體交感神經-腎上腺機能而呈現(xiàn)溫熱藥性;同時也說明溫中散寒藥的溫熱藥性與其溫中散寒功效存在一致性，本研究為揭示溫熱藥性的本質與科學內涵提供了實驗依據。

此外，本研究采用石膏、黃連2味歸胃經的寒涼藥作為反性對照藥給予胃實寒證大鼠灌胃治療，結果與空白組比較，各項指標比較差異有統(tǒng)計學意義，再次說明寒涼因素可導致胃實寒證;與模型組比較，尿液17-OHCS含量及血清ACTH含量比較差異有統(tǒng)計學意義，說明反性對照藥在一定程度上對胃實寒證大鼠有疊加效應，有加重胃實寒證的作用。這些結果從反面證明了中醫(yī)“寒者熱之”、“療寒以熱藥”理論的正確性。10味溫中散寒藥與之比較，尿液17-OHCS、CAs含量及血清ACTH、D-β-H含量均升高，除6味溫中散寒藥對17-OHCS含量比較差異無統(tǒng)計學意義之外，其余均有統(tǒng)計學意義，再次證明溫熱藥有增強機體交感神經-腎上腺機能作用。

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Effects of the Ten Herbs of Warming Middle-jiao and Dispelling Cold on the Sympathetic-adrenal System Function of Rats with Stomach Excess Cold Syndrome

HUANG Yan-qiong1，QIN Hua-zhen2△，YU Teng-fei2，LIU Ying2，TAN Xi-mei2，LI Wen-qiang2，WONG Ming-zuan2，ZHANG Xing-yan2，WANG Qin2
(1．Ruikang Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，China; 2．Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China)

Objective:To observe the effects of ten herbs of warming middle-jiao and dispelling cold on the output of 17-OHCS and CAs in the urine of rats with stomach excess cold syndrome，and the content of ACTH and DβH in their serum．With these works we are trying to investigate the action of the ten herbs to the sympathetic-adrenal system function of the rats and reveal the nature of the ten herbs of warm and hot．Methods:A total of 10 rats chosen from 150 SPF male SD rats were randomly selected in blank group．Dose the rest rats the decoction of Zhimu with 4℃ water to establish stomach excess cold pattern．Then divide the rats into model group，positive group，10 treatment drug groups，and 2 Antinature drug groups．Determine the content of 17-OHCS and CAs output(including Ad，NE，DA)in rat’s urine，and the level of ACTH and D-β-H in serum．Results:The contents of 17-OHCS，CAs，ACTH and D-β-H of the model groups were reduced，however，all of the index in treatment groups are significantly increased．Conclusion:The ten herbs of warming middle-jiao and dispelling cold can improve the sympathetic-adrenal system function．The method of them to cure the stomach excess cold syndrome is by enhancing the body sympathetic-adrenal cortex．

Warming middle-jiao and dispelling cold drugs;Stomach excess cold syndrome;17-OHCS;CAs; ACTH;D-β-H;Sympathetic-adrenal system function; Drugsnature

R289．1

B

1006-3250(2016)01-0119-03

2015-05-02

國家自然科學基金資助項目(81060348)-基于胃實寒證的溫中散寒藥性效本質研究

黃燕瓊，主管藥師，醫(yī)學碩士，從事中藥理論與中藥應用開發(fā)研究。

△通訊作者:秦華珍，教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，從事中藥理論與中藥藥效研究，Tel:13807816597，E-mail: qinhuazhen@126．com。