付小衛(wèi)，宋長恒，張治國，于 崢，劉 紅，潘靜華，李 艷，王少君，汪文來，李岳澤，吳佳瑩，趙宏艷，劉梅潔，鞠大宏△

(1．陜西中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，陜西咸陽 712046; 2．中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

從OPG-RANKL破骨細胞調控通路和Wnt成骨細胞調控通路探討“腎主骨”的性別差異及其機制*

付小衛(wèi)1，宋長恒2，張治國2，于 崢2，劉 紅2，潘靜華2，李 艷2，王少君2，汪文來2，李岳澤2，吳佳瑩2，趙宏艷2，劉梅潔2，鞠大宏2△

(1．陜西中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，陜西咸陽 712046; 2．中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

目的:從OPG-RANKL破骨細胞調控通路和Wnt成骨細胞調控通路的角度，部分揭示“腎主骨”的性別差異及其機制。方法:選用同齡雌、雄SD大鼠160只，雌雄各半，共分為雌雄空白對照組、雌雄假手術組、OVX組、ORX組、E2組、T組、雌雄左歸丸組、雌雄右歸丸組12組，并采用卵巢切除和睪丸切除的方法制作腎虛OP動物模型。在去勢后10 d，各給藥組開始灌胃給予相應的藥物，每天1次，連續(xù)6 d，休息1d后再連續(xù)給藥6 d，如此給藥3個月。給藥結束后，將各組大鼠處死取雙側脛骨進行各項指標的檢測。結果:左歸丸對OVX大鼠OP具有明顯療效，而對ORX大鼠OP沒有療效;右歸丸對OVX大鼠和ORX大鼠OP雖均有明顯療效，但對OVX大鼠的療效要明顯優(yōu)于ORX大鼠。左歸丸能使OVX大鼠骨髓中RANKL蛋白表達顯著下調，而使OPG蛋白表達顯著上調;同時使Wnt1和β-catenin蛋白表達顯著下調，而左歸丸對ORX大鼠的以上指標無明顯影響。右歸丸對OVX大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表達的作用與左歸丸的相同，只是右歸丸的作用強度要明顯大于左歸丸。右歸丸能使ORX大鼠骨髓中RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表達均顯著下調，但對OPG蛋白表達無明顯影響，并對RANKL、Wnt1和βcatenin的作用要明顯弱于對OVX大鼠的作用。結論:“腎主骨”存在性別差異，OPG-RANKL破骨細胞調控通路和Wnt成骨細胞調控通路發(fā)生不同改變，是造成這種差異的機制之一。

腎主骨;OPG-RANKL破骨細胞調控通路;Wnt成骨細胞調控通路

“腎主骨”是中醫(yī)的重要理論之一，是中醫(yī)治療骨質疏松癥(OP)的主要理論基礎。長期大量的臨床實踐表明，依據該理論進行遣方用藥能取得較好的臨床療效。中醫(yī)學認為，男女陰陽稟賦相異，生長壯老發(fā)展的各個階段皆有不同，這就造成男女之間在生理和病理上存在明顯差異。“腎主骨”是否也存在性別差異，若存在其機制如何?對此本實驗采用卵巢切除(OVX)和睪丸切除(ORX)大鼠作為腎虛OP動物模型，從OPG-RANKL破骨細胞調控通路和Wnt成骨細胞調控通路的角度，探討“腎主骨”的性別差異及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取9周齡SPF級SD大鼠160只，雌雄各半，雄鼠體質量250～270 g，雌鼠體質量200～220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(許可證號SCXK(軍)2007-004)，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所清潔級實驗動物室(實驗動物使用許可證號SYXK (京)2010-0032)。

1.1.2 藥物 左歸丸藥液由熟地24 g、山藥12 g、枸杞子12 g、山萸肉12 g、川牛膝9 g、莬絲子12 g、龜板膠12 g、鹿角膠12 g組成，常規(guī)水煎制成濃度為0.968 g生藥/ml的藥液。右歸丸藥液由熟地24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、當歸9 g、肉桂6 g、制附子6 g組成，常規(guī)水煎制成濃度為1.024 g生藥/ml的藥液。以上中藥均經中國中醫(yī)科學院中藥研究所生藥室鑒定。

戊酸雌二醇1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產品(批號234A)，臨用時將其碾碎后用純凈水制成濃度為0.0092 mg/ml的混懸液。甲睪酮5 mg/片，上海信誼康捷藥業(yè)有限公司產品(批號110801)，臨用時將其碾碎后用純凈水制成濃度為0.092 mg/ml的混懸液。

1.1.3 主要試劑及儀器 大鼠骨保護素(OPG);細胞核因子-κB受體活化因子配基(RANKL);Wnt1和 β-catenin抗體，美國 SANTA CRUZ公司產品(批號 F1813、E1613、B0113、G1813);山羊超敏二步法檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司進口分裝(批號K133312D)。

CRYOTOME FSE冰凍切片機，美國Thermo公司產品;Reicheit-Jung 2040切片機、DM6000 B顯微鏡、Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將160只同齡SD大鼠，根據性別按體質量分為6組，其中雌性空白對照組和雄性空白對照組各12只，雌性假手術組和雄性假手術組各12只，雌性造模組和雄性造模組各56只。按照文獻［1］方法切除雌性造模組大鼠的雙側卵巢，按照文獻［2］方法切除雄性造模組大鼠的雙側睪丸。雌性假手術組和雄性假手術組的手術過程同上，但不摘除卵巢或睪丸。以上雄性假手術組有1只、造模組雌、雄性大鼠因手術各有3只于當天死亡。

在術后10 d，再將兩造模組大鼠以體質量按隨機數(shù)字表法分為OVX組13只，ORX組14只，戊酸雌二醇組(E2組)14只，甲睪酮組(T組)13只，雌性左歸丸組13只，雄性左歸丸組13只，雌性右歸丸組13只，雄性右歸丸組13只共8組。分組后開始對各給藥組大鼠灌胃給藥，雌、雄左歸丸組大鼠分別給予濃度為0.968 g生藥/ml的左歸丸藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質量，給藥劑量為9.68 g生藥/kg體質量;雌、雄右歸丸組大鼠給予濃度為1.024 g生藥/ml的右歸丸藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質量，給藥劑量為10.24 g生藥/kg體質量;E2組大鼠給予濃度為0.0092 mg/ml的戊酸雌二醇藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質量，給藥劑量為0.092 mg/kg體質量;T組大鼠給予濃度為0.092 mg/ml的甲睪酮藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質量，給藥劑量為0.92 mg/kg體質量。以上各組給藥劑量均為成人臨床用量的6.5倍，雌雄空白對照組、雌雄假手術組、OVX組、ORX組大鼠按上法灌服等體積的純凈水。以上給藥、給水每天1次，連續(xù)6 d，休息1 d后再連續(xù)給藥6 d，如此給藥3個月。每周稱重1次，根據體質量調整給藥量。在給藥過程中，雌性右歸丸組和雄性左歸丸組各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡。

各組大鼠分別于處死前16 d和前3 d腹腔注射鹽酸四環(huán)素(劑量為30 mg/kg體質量)，對骨組織進行熒光標記。給藥結束后，將大鼠以45 mg/kg體質量劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，然后迅速處死取右側脛骨，用4%多聚甲醛固定制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學指標的檢測;取左側脛骨制作脫鈣骨冰凍切片，用于骨髓中 OPG、RANKL、Wnt1和β-Catenin蛋白表達的檢測。

1.2.2 指標檢測 1)骨組織形態(tài)計量學指標測定:取右側脛骨塑料包埋，用2040切片機縱向切取5 μm不脫鈣骨切片，共制作2張，一張用甲苯胺藍染色，另一張則直接用于熒光觀察。采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，按照國際骨形態(tài)計量參數(shù)測量定義和計算標準，取大鼠脛骨骨骺線1 mm下，對不脫鈣骨切片進行形態(tài)計量［3-4］。①靜態(tài)參數(shù)。骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是反映骨量多少的重要指標;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可反映破骨細胞活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞被覆的類骨質表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷成骨細胞活性;骨丟失率= (某只大鼠脛骨TBV% －同性別空白對照組脛骨TBV%平均值)/同性別空白對照組脛骨TBV%平均值×100%。骨丟失率為正值時，表示骨量增加，絕對值越大表示骨量增加越多;為負值時，表示骨量丟失，絕對值越大表示骨量丟失越多。②動態(tài)參數(shù)。骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面四環(huán)素熒光雙標記帶平均距離/2次標記相隔的天數(shù)，反映骨小梁骨礦化速度;骨皮質礦化率(mAR):皮質內表面四環(huán)素熒光雙標記帶平均距離/2次標記相隔的天數(shù)，反映皮質骨礦化速度。

2)OPG、RANKL、Wnt1及－catenin蛋白表達的檢測:取大鼠左側脛骨近端1/3去除周圍軟組織，用4%多聚甲醛(0.01M PBS配制，pH 7.3，含1‰DEPC)固定;置于4℃冰箱48 h后，用0.01 M PBS (pH7.3，含1‰DEPC)充分洗滌骨組織，然后放入10%EDTA·Na20.01 M PBS(pH7.3，含1‰DEPC)中脫鈣。置于4℃冰箱每天換液1次。脫鈣結束后，用1‰DEPC水配制的0.01M PBS充分洗滌骨組織，隨后浸入15%蔗糖，4℃冰箱保存。用冷凍切片機切取6 μm厚的縱向脫鈣骨切片，貼于經1%多聚賴氨酸涂片的載玻片上，－20℃冰箱保存待測。

按照所附說明書采用免疫組織化學染色方法檢測大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL、Wnt1及-catenin蛋白的表達。結果判斷，骨髓中陽性反應細胞胞漿著色呈棕黃色。采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)進行檢測，隨機檢測骨骺線1 mm下髓腔內5個以上高倍視野(×400)，計算每個視野的陽性面積比，取其平均值。陽性面積比為每個視野內胞漿著色呈棕黃色的陽性細胞面積占視野內骨髓腔面積的百分比，以其作為陽性反應細胞密度(簡稱陽性密度)。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果以均數(shù)±標準差(±s)表示，若數(shù)據為正態(tài)分布則采用單因素方差分析;方差齊性組間兩兩比較采用 LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3(3)檢驗。若數(shù)據呈非正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis單因素方差分析(k樣本)(W)進行處理;組間兩兩比較，采用其項下的Stepwise step-down檢驗。

2 結果

2.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學指標的影響

2.1.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨TBV%及骨丟失率的影響 表1顯示，OVX組以及雌性各給藥組大鼠脛骨TBV%均顯著低于雌性假手術組;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的 TBV%均顯著增加;雌性右歸丸組的TBV%明顯高于雌性左歸丸組。與此相應，OVX組以及雌性各給藥組大鼠脛骨骨丟失率(絕對值，下同)較雌性假手術組均顯著增加;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的骨丟失率均顯著減少;雌性右歸丸組的骨丟失率較雌性左歸丸組明顯減少。與雄性假手術組比較，ORX組以及雄性各給藥組的TBV%均顯著減少;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組的TBV%顯著增加，而雄性左歸丸組的無顯著性變化，雄性右歸丸組的TBV%顯著高于雄性左歸丸組。與此相應，與雄性假手術組比較，ORX組以及雄性各給藥組的骨丟失率均顯著增加;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組的骨丟失率顯著減少，而雄性左歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;雄性右歸丸組的骨丟失率顯著低于雄性左歸丸組。ORX組的TBV%顯著高于OVX組，其骨丟失率顯著低于OVX組;雄性左歸丸組與雌性左歸丸組比較TBV%差異無統(tǒng)計學意義，但骨丟失率顯著增加;雄性右歸丸組與雌性右歸丸組比較TBV%差異無統(tǒng)計學意義，但骨丟失率亦顯著增加。

表1 各組大鼠脛骨TBV%和骨丟失率的變化

表2 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%及其TRS/TFS變化比較

2.1.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨TRS%、TFS%及TRS/TFS比值的影響

表2顯示，與雌性假手術組比較，OVX組和雌性左歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著增加，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組的以上3個指標較雌性左歸丸組均明顯減少。除T組外，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS較雄性假手術組均顯著增加;與ORX組比較，T組、雄右歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著減少，而雄性左歸丸組無顯著性變化;雄性右歸丸組的以上3個指標均低于雄性左歸丸組。ORX組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明顯低于OVX組;雄性左歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明顯高于雌性左歸丸組;雄性右歸丸組以上3個指標均明顯高于雌性右歸丸組。

2.1.3 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨MAR和mAR的影響 表3顯示，OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨MAR及mAR較雌性假手術組均顯著增加，E2組、雌性右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的 MAR及mAR均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組的MAR及mAR較雌性左歸丸組顯著減少。ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的MAR及mAR均高于雄性假手術組，而T組比較差異無統(tǒng)計學意義;與ORX組比較，除雄性左歸丸組外，T組和雄性右歸丸組的MAR及mAR均顯著減少;雄性右歸丸組的MAR及mAR低于雄性左歸丸組。ORX組的MAR、mAR較OVX組顯著減少;雄性左歸丸組的MAR、mAR顯著高于雌性左歸丸組;雄性右歸丸組顯著高于雌性右歸丸組。

表3 各組大鼠脛骨MAR及mAR的變化

圖1 各組大鼠脛骨骨髓OPG蛋白表達陽性密度變化

圖2 各組大鼠脛骨骨髓RANKL蛋白表達陽性密度變化

2.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表達及其比值-RANKL/OPG的影響

2.2.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達的影響 圖1顯示，與雌性假手術組、OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達陽性密度顯著降低，而雌性右歸丸組、E2組的陽性密度比較差異無統(tǒng)計學意義;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度均顯著增高;雌性右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度明顯高于雌性左歸丸組。除T組外，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度均低于雄性假手術組;與ORX組比較，T組的OPG蛋白表達陽性密度顯著增高，而雄性左歸丸組和右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;雄性右歸丸組與雄性左歸丸組比較OPG蛋白表達陽性密度差異無統(tǒng)計學意義。ORX組的OPG蛋白表達陽性密度明顯高于OVX組;雄性左歸丸組明顯低于雌性左歸丸組，雄性右歸丸組明顯低于雌性右歸丸組。

2.2.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達以及RANKL/OPG比值的影響 圖2、3顯示，OVX組和雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達陽性密度以及RANKL/ OPG比值較雌性假手術組均顯著升高，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組RANKL蛋白表達陽性密度以及RANKL/OPG比值均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組較雌性左歸丸組明顯降低。與雄性假手術組比較，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組RANKL蛋白表達陽性密度以及RANKL/OPG比值均顯著升高，而T組比較差異無統(tǒng)計學意義;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組RANKL蛋白表達陽性密度以及RANKL/OPG比值顯著下降，而雄性左歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;雄性右歸丸組明顯低于雄性左歸丸組。ORX組的RANKL蛋白表達陽性密度以及RANKL/OPG比值較OVX組明顯降低;雄性左歸丸組較雌性左歸丸組明顯增高，雄性右歸丸組較雌性右歸丸組也明顯增高。

圖3 各組大鼠脛骨骨髓RANKL/OPG比值的變化

2.3 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中Wnt1和-catenin蛋白表達的影響

2.3.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中Wnt1蛋白表達的影響 圖4顯示，與雌性假手術組比較，OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中Wnt1蛋白表達陽性密度顯著增高，而E2組、雌性右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的Wnt1蛋白表達陽性密度均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組明顯低于雌性左歸丸組。ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組Wnt1蛋白表達陽性密度均顯著高于雄性假手術組，而T組比較差異無統(tǒng)計學意義;T組、雄性右歸丸組Wnt1蛋白表達陽性密度較ORX組顯著降低，而雄性左歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;雄性右歸丸組較雄性左歸丸組顯著降低。雄性左歸丸組與雌性左歸丸組、雄性右歸丸組與雌性右歸丸組比較，Wnt1蛋白表達陽性密度均明顯增高，ORX組顯著低于OVX組。

圖4 各組大鼠脛骨骨髓Wnt1蛋白表達陽性密度變化

2.3.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓-catenin蛋白表達的影響圖5顯示，OVX組和雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中-catenin蛋白表達陽性密度較雌性假手術組顯著增高，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組-catenin蛋白表達陽性密度較OVX組均顯著降低;雌性右歸丸組明顯低于雌性左歸丸組。與雄性假手術組比較，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組-catenin蛋白表達陽性密度皆顯著增高，而T組比較差異無統(tǒng)計學意義;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組-catenin蛋白表達陽性密度顯著降低，而雄性左歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義。ORX組-catenin蛋白表達陽性密度顯著低于OVX組，雄性左歸丸組明顯高于雌性左歸丸組，雄性右歸丸組明顯高于雌性右歸丸組。

圖5 各組大鼠脛骨骨髓-catenin蛋白表達陽性密度變化

雌、雄假手術組與其各自空白對照組比較，上述指標均未發(fā)生顯著性變化，從而排除了手術因素對實驗的影響。

3 討論

本實驗結果顯示，OVX組和ORX組大鼠脛骨TBV%均顯著低于各自的假手術組，與之相應，兩者的骨丟失率均顯著高于各自的假手術組;ORX組的TBV%顯著高于OVX組，骨丟失率則顯著低于OVX組。這一結果說明，去勢均可造成骨量丟失并發(fā)生OP;但雌性大鼠丟失的骨量要明顯多于同齡的雄性大鼠，表明去勢所導致的骨量丟失存在著性別差異。

本實驗結果進一步顯示，在OVX組和ORX組TBV%較各自假手術組減少的同時，兩者反映骨吸收的指標TRS%、TRS/TFS以及反映骨形成的指標TFS%、MAR、mAR均顯著增加。這一結果表明，OVX和ORX所造成的均是高轉換型的OP，即骨吸收與骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，而導致骨量丟失發(fā)生OP。骨形成是以骨吸收為前提的，去勢所導致的骨形成增加是一種代償性增加，如果骨吸收得到了抑制，骨形成也就隨之降低。不同性別大鼠去勢雖均可導致高轉換型的OP，但也存在著性別差異，表現(xiàn)在ORX組的TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯明低于OVX組，其中TRS/ TFS能反映骨轉換的程度，代表骨轉換率。這表明ORX所造成的高轉換程度要明顯低于OVX所造成的程度，即兩者在高轉換程度上存在性別差異。

OPG-RANKL-RANK是調控破骨細胞(OC)分化和功能的重要通路［5］。各種骨吸收刺激因子作用于成骨細胞(OB)和骨髓基質細胞(MSC)，使其表達RANKL，RANKL與OC前體細胞和OC表面上的RANK結合，從而促進OC的分化、成熟和激活，引起骨吸收;而OB和MSC又可分泌OPG，其與RANK競爭性結合RANKL，阻止RANKL與RANK之間的結合，抑制OC的分化、成熟，從而防止骨的過度吸收［6-8］。由此可以看出，RANKL與OPG共同調控著OC的功能，使之發(fā)揮正常功能;若兩者發(fā)生異常改變，就可能使OC的功能發(fā)生異常。本實驗結果顯示，與各自的假手術組比較，OVX組和ORX組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達陽性密度均顯著增高，而OPG蛋白表達陽性密度均顯著降低，兩者的比值-RANKL/OPG均顯著增加。與OVX組比較，ORX組的RANKL蛋白表達陽性密度明顯降低，OPG蛋白表達陽性密度明顯增高，RANKL/OPG明顯降低。這一結果表明，OVX和ORX均可使RANKL蛋白表達上調，而使OPG蛋白表達下調。這是它們均可導致OP發(fā)生的共同機制之一，但也存在著性別差異，表現(xiàn)在ORX所造成的RANKL蛋白表達上調以及OPG蛋白表達下調的程度均不如OVX所造成的程度。這就是為什么雌性大鼠丟失骨量要明顯多于同齡雄性大鼠的原因之一。

Wnt信號途徑是細胞發(fā)育和調節(jié)生長的一個關鍵途徑，在OB的定向分化、發(fā)育、增殖中起著關鍵性作用，是非常重要的骨代謝調控通路［9］。Wnt1和-catenin是其中的關鍵因子，它們表達增強可促進OB的定向分化、發(fā)育和增殖。本實驗結果顯示，OVX組和 ORX組大鼠脛骨骨髓中 Wnt1和 -catenin陽性密度均顯著高于各自的假手術組;而ORX組Wnt1和-catenin陽性密度均低于OVX組。這一結果表明，OVX和ORX均可導致 Wnt1/-catenin OB調控通路功能上調，使骨形成增加，但ORX所造成的上調幅度要低于OVX所造成的幅度。這是OVX和ORX均可導致骨形成增加的共同機制之一，但也存在著性別差異，即ORX增加的程度要低于OVX增加的程度。

本實驗結果顯示，與OVX組比較，雌性左歸丸組和雌性右歸丸組大鼠脛骨TBV%均顯著增加，骨丟失率均顯著減少，同時大鼠脛骨TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著減少，雌性右歸丸組與雌性左歸丸組比較，TBV%明顯增加，骨丟失率顯著減少，而TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著減少。以上結果表明，左、右歸丸均能抑制OVX所致骨的高轉換，使骨吸收和骨形成均降低并提高骨量，而對OP均具有治療作用;但右歸丸的療效要明顯優(yōu)于左歸丸。對于ORX所致OP大鼠，右歸丸對上述指標也能產生同樣的效應，進而達到治療作用;但左歸丸無此效應，因而也就無治療作用。本實驗結果顯示，與雌性左歸丸組比較，雄性左歸丸組的骨丟失率、TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著增加;與雌性右歸丸組比較，雄性右歸丸組的以上指標也出現(xiàn)相同結果。這一結果表明，左歸丸、右歸丸在治療OP方面存在性別差異，表現(xiàn)在左歸丸對OVX大鼠OP具有明顯的治療作用，而對ORX大鼠OP無治療作用;右歸丸對OVX大鼠OP和ORX大鼠OP雖均有治療作用，但對前者的療效要明顯優(yōu)于對后者的療效。

中醫(yī)理論認為“腎主骨”，腎精充實，骨髓化生有源，骨得其養(yǎng)則堅固有力;若腎精虧虛，骨髓化生乏源，骨失其養(yǎng)，就會出現(xiàn)骨脆易折、腰背疼痛等癥狀，即是現(xiàn)代醫(yī)學所說的OP。因此，“補腎”是治療OP的基本法則。左歸丸與右歸丸出自古代著名醫(yī)家張景岳的《景岳全書》。左歸丸具有滋補腎陰的功效，右歸丸具有溫補腎陽的功效。OVX和ORX所造成的是腎虛OP模型?；谝陨险J識，本實驗結果同時說明，“腎主骨”存在著性別差異。

本實驗結果顯示，與OVX組比較，雌性左歸丸組和右歸丸組大鼠脛骨骨髓中的OPG蛋白表達陽性密度均顯著增高，而RANKL蛋白表達陽性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達陽性密度均顯著降低;雌性右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度明顯高于雌性左歸丸組，而RANKL蛋白表達陽性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達陽性密度均低于雌性左歸丸組。這一結果說明，左、右歸丸均可通過對OPG-RANKL破骨細胞調控通路以及Wnt成骨細胞調控通路的調節(jié)而達到治療OVX大鼠OP的作用。表現(xiàn)在使OPG蛋白表達上調，使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達下調，從而使骨吸收與骨形成均降低，抑制骨的高轉換，使骨吸收與骨形成達到相對平衡狀態(tài)，從而防止骨量的丟失。這是左、右歸丸均能治療OVX大鼠OP的共同機理之一，所不同的是右歸丸對上述指標的作用強度要大于左歸丸。這也是右歸丸對OVX大鼠OP治療效果優(yōu)于左歸丸的機理之一。

與ORX組比較，雄性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度差異無統(tǒng)計學意義;但雄性右歸丸組的RANKL蛋白表達陽性密度、RANKL/ OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達陽性密度均顯著降低，而雄性左歸丸組以上指標均無顯著性變化。與雄性左歸丸組比較，雄性右歸丸組OPG的蛋白表達陽性密度無顯著性變化，但RANKL蛋白表達陽性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達陽性密度均顯著降低。這一結果說明，右歸丸對ORX大鼠骨髓中的OPG雖無明顯作用，但可通過下調RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達來達到治療OP的作用。左歸丸對以上指標均未產生明顯影響，所以對ORX大鼠OP無治療作用。

與雌性右歸丸組比較，雄性右歸丸組的OPG蛋白表達陽性密度降低，而RANKL蛋白表達陽性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達陽性密度均顯著增高;與雌性左歸丸組比較，雄性左歸丸組的以上指標也發(fā)生同樣的變化。通過這一結果，并結合同性別組間比較結果可以得到以下結論:右歸丸對OVX大鼠OP的治療效果之所以優(yōu)于其對ORX大鼠的治療效果，是由于以下兩個原因:①右歸丸不僅能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表達上調，而且還能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達下調，而右歸丸對ORX大鼠骨髓中OPG蛋白表達無明顯影響，而只能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達下調;②右歸丸雖均能使OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中的RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達下調，但對前者的作用強度要明顯大于對于后者。左歸丸能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表達上調，而使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達下調，而對ORX大鼠骨髓中的這些指標均未產生明顯影響，所以左歸丸對OVX大鼠OP有效，而對ORX大鼠OP無效。

綜上所述，“腎主骨”存在性別差異，OPGRANKL破骨細胞調控通路和Wnt成骨細胞調控通路發(fā)生不同改變，是造成這種差異的機制之一。

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表2 各組大鼠血清、BALF中IL-4水平變化(±s)

表2 各組大鼠血清、BALF中IL-4水平變化(±s)

注:與空白組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較:●P＜0.05，●●P＜0.01

組別 鼠數(shù) IL-4(ng/L)血清BALF空白組模型組羅 氟 司 特 組蘇 子 降 氣 組QZZF小 劑 量 組QZZF中 劑 量 組QZZF大 劑 量 組10 10 10 10 10 10 10 3.62±0.18 4.71±1.19▲▲3.60±0.31●●3.53±0.61●●4.12±0.94●3.94±0.51●●4.02±0.37●3.46±0.20 3.84±0.58▲3.57±0.22 3.48±0.17●3.68±0.20 3.48±0.16●●3.66±0.14

中醫(yī)學雖無“慢性阻塞性肺疾病”的病名，根據臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點，多屬于“咳嗽”“痰飲”“肺脹”等范疇，其病理特征為本虛標實，正氣虛弱為本，痰飲、血瘀、氣滯等為標。芪蛭皺肺顆粒是我們基于COPD的病機特點所擬定的治療方劑，具有益氣培元、活血化瘀、癟皺肺脹之功用。本實驗結果表明，芪蛭皺肺顆粒能夠降低COPD模型大鼠血清及BALF中 IL-4表達，升高動脈血氣中 pH、PaO2、SaO2，降低PaCO2含量，并可能存在一定的量效關系。表明通過調節(jié)血清及BALF中IL-4表達水平，減輕氣道炎癥浸潤，可能是提高肺通氣和肺換氣能力，增加血液中O2含量，減少CO2潴留，調節(jié)血液的酸堿平衡，從而干預COPD的發(fā)生發(fā)展。

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收稿日期:2015-04-12

R285．5

B

1006-3250(2016) 01-0066-07

2015-05-12

國家自然科學基金資助項目(81273889)

付小衛(wèi)(1978-)，男，陜西咸陽人，副教授，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)藥痹癥的臨床與基礎研究。

△通訊作者:鞠大宏(1963-)，男，遼寧鳳城人，研究員，博士研究生導師，從事中醫(yī)痹癥的臨床與基礎研究，E-mail: judahong@sohu．com。